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    • 5. 发明申请
    • One-step method for quantitative determination of uracil in DNA by real-time PCR
    • 通过实时PCR定量测定DNA中尿嘧啶的一步法
    • US20130071848A1
    • 2013-03-21
    • US13237987
    • 2011-09-21
    • Beata G. VertessyAndras HorvathVince Grolmusz
    • Beata G. VertessyAndras HorvathVince Grolmusz
    • C12Q1/68
    • C12Q1/686C12Q1/6827C12Q2521/101C12Q2523/125C12Q2545/114C12Q2561/113
    • Uracil may occur in DNA due to either cytosine deamination or thymine replacing incorporation. Its quantitative characterization is important in assessing DNA damages in cells with perturbed thymidylate metabolism or within different DNA segments involved in immunoglobulin gene diversification. The archaeal DNA polymerase from Pyrococcus furiosus binds strongly to the deaminated base uracil and stalls on uracil-containing templates. Here, we present a straightforward method for quantitative assessment of uracil in DNA within specific genomic segments. We use wild type Pyrococcus furiosus polymerase in parallel with its point mutant version which lacks the uracil-binding specificity on synthetic and genomial DNA samples to quantify the uracil content in a single-step real-time PCR assay. Quantification of the PCR results is based on an approach analogous to template copy number determination in comparing different samples. Data obtained on synthetic uracil-containing templates are verified by direct isotopic measurements.
    • 由于胞嘧啶脱氨基或胸腺嘧啶替代掺入,尿嘧啶可能发生在DNA中。 其定量表征在评估具有扰动的胸苷酸代谢的细胞中的DNA损伤中或在涉及免疫球蛋白基因多样化的不同DNA区段内是重要的。 来自火炬球菌的古菌DNA聚合酶与含尿嘧啶模板的脱氨基尿嘧啶和失速物强烈结合。 在这里,我们提出了一个直接的方法来定量评估特定基因组片段中的DNA的尿嘧啶。 我们使用野生型热激杆菌聚合酶与其点突变体版本并行,其缺乏在合成和基因型DNA样品上的尿嘧啶结合特异性,以在单步实时PCR测定中定量尿嘧啶含量。 PCR结果的定量基于在比较不同样品时类似于模板拷贝数确定的方法。 通过直接同位素测量验证含有合成含尿嘧啶的模板获得的数据。