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3. 发明专利

TWI325892B 基因重組載體、基因重組發光菌及其用於檢測生物抑制性物質之方法 RECOMBINANT DNA VECTOR, RECOMBINANT BIO-LUMINESCENT BACTERIUM AND METHOD FOR DETECTING BIO-INHIBITORY SUBSTANCES BY USING THEREOF 有权
简体标题：基因重组载体、基因重组发光菌及其用于检测生物抑制性物质之方法 RECOMBINANT DNA VECTOR, RECOMBINANT BIO-LUMINESCENT BACTERIUM AND METHOD FOR DETECTING BIO-INHIBITORY SUBSTANCES BY USING THEREOF
公开(公告)号：TWI325892B
公开(公告)日：2010-06-11
申请号：TW092136311
申请日：2003-12-19
申请人：財團法人工業技術研究院
发明人：楊琇瑩 , 賴信志 , 魏君容 , 林慧玲
IPC分类号： C12N
CPC分类号： C12Q1/6897 , C07K14/24 , C07K14/32
摘要：本發明係提供一種基因重組載體、基因重組發光菌以及利用該菌檢測廢水中生物抑制性物質之檢測方法，係應用生物抑制性物質可抑制或刺激該基因重組發光菌發光的原理，來達到檢測廢水中毒物含量之目的。 The present invention relates to recombinant DNA vector, recombinant bio-luminescent bacterium and method for detecting bio-inhibitory substances by using foregoing bacterium. Since bio-inhibitory substances can inhibit or stimulate the luminescence of recombinant bio-luminescent bacterium, the invention can detect the presence and amount of toxic substances in waste water. 【創作特點】有鑑於習知生物抑制性物質檢測分析技術之缺失，本發明之目的在於提供一種基因重組載體係包括：一段啟動子(Promoter)係包括shlA基因或fabG基因之全長、其片段序列、其衍生物(Derivative)或簡併序列(Degenerate sequence)；一段報導子(Reporter)，為可編碼(Encode)發光蛋白質之基因，係架構內(In-frame)連接於前述啟動子之後；以及一終止子。
前述之shlA基因係包括SEQ ID NO：3所述之序列、其片段序列、其衍生物(Derivative)或簡併序列(Degenerate sequence)。
前述之fabG基因係包括SEQ ID NO)：6所述之序列、其片段序列、其衍生物(Derivative)或簡併序列(Degenerate sequence)。
前述之”片段序列”係指本發明之前述基因中之部份序列。
前述之”衍生物”係指與本發明之前述基因序列相似度達到70%以上之序列片段，或者是於前述基因序列之3’或5’修飾有其他核苷酸且序列相似度達到70%以上之序列片段。
前述之”簡併序列”係指本發明之前述序列中部分(30%或以下)核苷酸為其他核苷酸所取代。
前述之發光蛋白質係為螢光(Fluorescent)或冷光(Luminescent)蛋白質。
前述之可編碼發光蛋白質之基因係選自下列群組發光蛋白質之基因：冷光蛋白(Luciferase)基因、綠色螢光蛋白(Green fluorescent protein)基因及藍色螢光蛋白(Blue fluorescent protein)基因。
前述之發光蛋白質較佳係為冷光蛋白(Luciferase)基因，且更佳係為luxCDABE基因。
前述之基因重組載體，係可包括一段選擇性標記基因(Selective marker)，且該選擇性標記基因較佳係為抗生素抗性(Antibiotic-resistant)基因。
前述之抗生素抗性基因係可選自下列群組：安比西林(Ampicillin)抗性基因、卡納黴素(Kanamycin)抗性基因、四環黴素(Tetracycline)抗性基因及鏈黴素(Streptomycin)抗性基因。
本發明之另一目的係提供一種基因重組發光菌，係包含shlA啟動子之基因重組載體，前述之基因重組發光菌係於民國92年10月17日寄存於食品工業發展研究所之菌種保存及研究中心，寄存編號為BCRC940434。
本發明之又一目的係提供一種基因重組發光菌，係包含fabG啟動子之基因重組載體，前述之基因重組發光菌係於民國92年10月17日寄存於食品工業發展研究所之菌種保存及研究中心，寄存編號為BCRC940433。
本發明亦關於一種可用以檢測生物抑制性物質之基因重組發光菌，其係包含有前述之基因重組載體，該基因重組發光菌係可感應生物抑制性物質的濃度，於生物抑制性物質的濃度越高的情形下其發光程度越低。
前述之可用以檢測生物抑制性物質之基因重組發光菌，其較佳係為腸內桿菌，例如：大腸桿菌(Escherichia coli)或黏質沙雷氏桿菌(Serratia marcescens)，更佳係為黏質沙雷氏桿菌(Serratia marcescens)。
本發明之再一目的係提供一種用於檢測生物抑制性物質之方法，係包括：取得待測樣品；使待測樣品與前述之基因重組發光菌充分混合反應；以及偵測前述基因重組發光菌之發光度，藉由發光度降低的程度判斷待測樣品中生物抑制性物質的多寡。
前述所謂”生物抑制性物質”係指重金屬物質、有機物質或金屬離子等等會抑制生物正常生理機能之毒性物質。
简体摘要：本发明系提供一种基因重组载体、基因重组发光菌以及利用该菌检测废水中生物抑制性物质之检测方法，系应用生物抑制性物质可抑制或刺激该基因重组发光菌发光的原理，来达到检测废水中毒物含量之目的。 The present invention relates to recombinant DNA vector, recombinant bio-luminescent bacterium and method for detecting bio-inhibitory substances by using foregoing bacterium. Since bio-inhibitory substances can inhibit or stimulate the luminescence of recombinant bio-luminescent bacterium, the invention can detect the presence and amount of toxic substances in waste water. 【创作特点】有鉴于习知生物抑制性物质检测分析技术之缺失，本发明之目的在于提供一种基因重组载体系包括：一段启动子(Promoter)系包括shlA基因或fabG基因之全长、其片段串行、其衍生物(Derivative)或简并串行(Degenerate sequence)；一段报导子(Reporter)，为可编码(Encode)发光蛋白质之基因，系架构内(In-frame)连接于前述启动子之后；以及一终止子。前述之shlA基因系包括SEQ ID NO：3所述之串行、其片段串行、其衍生物(Derivative)或简并串行(Degenerate sequence)。前述之fabG基因系包括SEQ ID NO)：6所述之串行、其片段串行、其衍生物(Derivative)或简并串行(Degenerate sequence)。前述之”片段串行”系指本发明之前述基因中之部份串行。前述之”衍生物”系指与本发明之前述基因串行相似度达到70%以上之串行片段，或者是于前述基因串行之3’或5’修饰有其他核苷酸且串行相似度达到70%以上之串行片段。前述之”简并串行”系指本发明之前述串行中部分(30%或以下)核苷酸为其他核苷酸所取代。前述之发光蛋白质系为萤光(Fluorescent)或冷光(Luminescent)蛋白质。前述之可编码发光蛋白质之基因系选自下列群组发光蛋白质之基因：冷光蛋白(Luciferase)基因、绿色萤光蛋白(Green fluorescent protein)基因及蓝色萤光蛋白(Blue fluorescent protein)基因。前述之发光蛋白质较佳系为冷光蛋白(Luciferase)基因，且更佳系为luxCDABE基因。前述之基因重组载体，系可包括一段选择性标记基因(Selective marker)，且该选择性标记基因较佳系为抗生素抗性(Antibiotic-resistant)基因。前述之抗生素抗性基因系可选自下列群组：安比西林(Ampicillin)抗性基因、卡纳霉素(Kanamycin)抗性基因、四环霉素(Tetracycline)抗性基因及链霉素(Streptomycin)抗性基因。本发明之另一目的系提供一种基因重组发光菌，系包含shlA启动子之基因重组载体，前述之基因重组发光菌系于民国92年10月17日寄存于食品工业发展研究所之菌种保存及研究中心，寄存编号为BCRC940434。本发明之又一目的系提供一种基因重组发光菌，系包含fabG启动子之基因重组载体，前述之基因重组发光菌系于民国92年10月17日寄存于食品工业发展研究所之菌种保存及研究中心，寄存编号为BCRC940433。本发明亦关于一种可用以检测生物抑制性物质之基因重组发光菌，其系包含有前述之基因重组载体，该基因重组发光菌系可感应生物抑制性物质的浓度，于生物抑制性物质的浓度越高的情形下其发光程度越低。前述之可用以检测生物抑制性物质之基因重组发光菌，其较佳系为肠内杆菌，例如：大肠杆菌(Escherichia coli)或黏质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)，更佳系为黏质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)。本发明之再一目的系提供一种用于检测生物抑制性物质之方法，系包括：取得待测样品；使待测样品与前述之基因重组发光菌充分混合反应；以及侦测前述基因重组发光菌之发光度，借由发光度降低的程度判断待测样品中生物抑制性物质的多寡。前述所谓”生物抑制性物质”系指重金属物质、有机物质或金属离子等等会抑制生物正常生理机能之毒性物质。

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