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    • 7. 发明申请
    • VERFAHREN FÜR DIE KONTINUIERLICHE ZIELGERICHTETE EVOLUTION VON PROTEINEN IN VITRO
    • 过程在蛋白质的不断发展目标锁定在体外
    • WO2007017229A2
    • 2007-02-15
    • PCT/EP2006/007798
    • 2006-08-07
    • GENEART AGLISS, Michael
    • LISS, Michael
    • C12N15/10C40B10/00
    • C12N15/1058C12N15/1055C12N15/1075C40B10/00
    • Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Varianten eines Proteins in einem in vitro Evolutionsverfahren, umfassend die Schritte: (A) Bereitstellen eines in vitro -Expressionssystems, umfassend (i) eine Nukleinsäuresequenz S, die für ein zu variierendes Protein Y kodiert, (ii) ein Zielmolekül X 1 welches in der Lage ist, an das Protein Y und/oder mindestens eine Variante Y davon zu binden, (iii) eine RNA-Polymerase (Pol), welche in der Lage ist, die Nukleinsäuresequenz S zu transkribieren, (iv) eine Reverse Transkriptase (RT), welche in der Lage ist, Transkripte der Nukleinsäuresequenz S revers zu transkribieren, wobei entweder das Zielmolekül X an Pol und das Protein Y an RT gekoppelt ist, oder das Zielmolekül X an RT und das Protein Y an Pol gekoppelt ist, (B) Inkubieren des in vitro Expressionssystems aus (A) unter Bedingungen, welche eine Transkription, eine Reverse Transkription und eine Translation unter Bildung von Varianten Y ´ des Proteins Y und dafür kodierender Nukleinsäuresequenzen S ´ ermöglichen, und welche die Bildung von Varianten Y ´ mit verbesserten Bindungseigenschaften für das Zielmolekül X begünstigen, (C) Isolieren und gegebenenfalls Charakterisieren derjenigen Varianten Y ´ , welche verbesserte Bindungseigenschaften für die Bindung an X aufweisen und/oder Isolieren von für Y ´ kodierenden Nukleinsäuresequenzvarianten S ´ .
    • 本发明涉及生产在体外进化方法,包括以下步骤的蛋白的变体的:(A)提供一种在体外表达系统包括(i)的核酸序列S这对于一个被改变蛋白质Y代码,(II) 目标分子X 1 其能够与蛋白质Y和/或至少一种变体y以它们的结合,(ⅲ)RNA聚合酶(POL),其能够 转录的核酸序列S,(ⅳ)反转录酶(RT),其能够,S转录的核酸序列的反向,其中任目标分子X耦合到Pol和蛋白质y以RT,或目标分子X到的转录物 RT和条件转录,逆转录和翻译,以形成下孵育选自(a)在体外表达系统中的蛋白Y被耦合至波尔,(B)变体ÿ Protei的 NS Y和对编码核酸序列小号 允许和变体ÿ的形成的青睐与目标分子X分离和任选地表征那些变体改善的结合性质,(C) ÿ ,它具有改进的结合特性的结合X,和/或用于分离ÿ'的核酸序列编码变体取值