会员体验
专利管家(专利管理)
工作空间(专利管理)
风险监控(情报监控)
数据分析(专利分析)
侵权分析(诉讼无效)
联系我们
交流群
官方交流:
QQ群: 891211   
微信请扫码    >>>
现在联系顾问~
首页 / 专利分类库 / 农业;林业;畜牧业;狩猎;诱捕;捕鱼 / 鱼类、鱼类的生产方法和熟化加速的鱼类的生产方法

鱼类、鱼类的生产方法和熟化加速的鱼类的生产方法

申请号 CN202380023318.9 申请日 2023-06-14 公开(公告)号 CN118804681A 公开(公告)日 2024-10-18
申请人 国立大学法人京都大学; 学校法人近畿大学; 瑞吉诺水产研究所有限公司; 发明人 木下政人; 家户敬太郎; 鹫尾洋平; 村上悠; 岸本谦太; 本田祐基; R·S·服部;
摘要 提供可增加或 加速 熟化时的肌苷酸蓄积的鱼类。本 发明 的鱼类中,胞外5’‑核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能。
权利要求

1.一种鱼类,其胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能。

2.根据权利要求1所述的鱼类,其包含nt5e基因功能丧失体,所述功能丧失体为在正常的nt5e基因的基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的突变基因。

3.根据权利要求2所述的鱼类,其中,所述功能丧失体为在所述正常的nt5e基因的碱基序列中缺失了至少一部分碱基而成的突变基因。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的鱼类,其包含nt5e基因功能丧失体,所述功能丧失体为相对于正常的nt5e基因的碱基序列包含移码突变的突变基因。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的鱼类,其包含nt5e基因功能丧失体,所述功能丧失体为相对于正常的nt5e基因的碱基序列包含无义突变的突变基因。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的鱼类,其包含nt5e基因功能丧失体,所述功能丧失体为在正常的nt5e基因的第1外显子中包含突变的基因。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的鱼类,所述鱼类为真鲷(所述真鲷的正常的nt5e基因为包含下述(Pn)的多核苷酸的基因:(Pn)下述(Pn1)~(Pn7)中的任一多核苷酸:

(Pn1)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸;

(Pn2)由在所述(Pn1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加基酸而成的氨基酸序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pn7)编码由相对于序列号2的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为真鲷(所述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在正常的nt5e基因的外显子1和外显子6的至少一者中具有突变的突变基因。

9.根据权利要求8所述的鱼类,其中,所述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在所述正常的nt5e基因的外显子6中具有突变且相对于所述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。

10.根据权利要求2至9中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为真鲷(所述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在序列号1的碱基序列中的第1014~1036位的碱基中具有突变的突变基因。

11.根据权利要求2至6中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为红鳍东方鲀(所述红鳍东方鲀的正常的nt5e基因为包含下述(Pt)的多核苷酸的基因:(Pt)下述(Pt1)~(Pt7)中的任一多核苷酸:

(Pt1)由序列号3的碱基序列构成的多核苷酸;

(Pt2)由在所述(Pt1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pt3)由相对于所述(Pt1)的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pt4)由与由所述(Pt1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pt5)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;

(Pt6)编码由在序列号4的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pt7)编码由相对于序列号4的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。

12.根据权利要求2至6以及11中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为红鳍东方鲀(所述红鳍东方鲀包含作为nt5e基因功能丧失体的、在正常的nt5e基因的正常基因的外显子1中具有突变的突变基因。

13.根据权利要求12所述的鱼类,其中,所述红鳍东方鲀包含作为nt5e基因功能丧失体的、在所述正常的nt5e基因的外显子1中具有突变且相对于所述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。

14.根据权利要求2至6以及11至13中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为红鳍东方鲀(所述红鳍东方鲀中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号3的碱基序列中的第131~153位的碱基中具有突变。

15.根据权利要求2至6中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为罗非鱼(所述罗非鱼的正常的nt5e基因为包含下述(Po)的多核苷酸的基因:(Po)下述(Po1)~(Po7)中的任一多核苷酸:

(Po1)由序列号5的碱基序列构成的多核苷酸;

(Po2)由在所述(Po1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Po3)由相对于所述(Po1)的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Po4)由与由所述(Po1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Po5)编码由序列号6的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;

(Po6)编码由在序列号6的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Po7)编码由相对于序列号6的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。

16.根据权利要求2至6以及15中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为罗非鱼(所述罗非鱼包含作为nt5e基因功能丧失体的、在nt5e基因的正常基因的外显子1中具有突变的突变基因。

17.根据权利要求16所述的鱼类,其中,所述罗非鱼包含作为nt5e基因功能丧失体的、在所述正常的nt5e基因的外显子1中具有突变且相对于所述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。

18.根据权利要求2至6以及15至17中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为罗非鱼(所述罗非鱼中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号5的碱基序列中的第217~239位的碱基中具有突变。

19.根据权利要求2至6中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为牙鲆(所述牙鲆的正常的nt5e基因为包含下述(Pp)的多核苷酸的基因:(Pp)下述(Pp1)~(Pp7)中的任一多核苷酸:

(Pp1)由序列号11的碱基序列构成的多核苷酸;

(Pp2)由在所述(Pp1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pp3)由相对于所述(Pp1)的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pp4)由与由所述(Pp1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pp5)编码由序列号12的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;

(Pp6)编码由在序列号12的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pp7)编码由相对于序列号12的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。

20.根据权利要求2至6以及19中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为牙鲆(所述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在nt5e基因的正常基因的外显子4中具有突变的突变基因。

21.根据权利要求20所述的鱼类,其中,所述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在所述正常的nt5e基因的外显子4中具有突变且相对于所述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。

22.根据权利要求2至6以及19至21中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为牙鲆(所述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在序列号11的碱基序列中的第605~627位的碱基中具有突变。

23.根据权利要求2至6中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为革胡子鲶(所述革胡子鲶的正常的nt5e基因为包含下述(Pq)的多核苷酸的基因:(Pq)下述(Pq1)~(Pq7)中的任一多核苷酸:

(Pq1)由序列号25的碱基序列构成的多核苷酸;

(Pq2)由在所述(Pq1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pq3)由相对于所述(Pq1)的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pq4)由与由所述(Pq1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pq5)编码由序列号26的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;

(Pq6)编码由在序列号26的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;

(Pq7)编码由相对于序列号26的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。

24.根据权利要求2至6、8至10、12至14、16至18以及20至22中任一项所述的鱼类,其中,所述功能丧失体编码肌苷酸的分解活性下降的突变NT5E蛋白。

25.根据权利要求1至6中任一项所述的鱼类,其中,所述鱼类为选自由鲀科、鲷科、鲑科、鲤科、鮨科、牙鲆科、胡鲇科和慈鲷科组成的组中的鱼类。

26.一种权利要求1至25中任一项所述的鱼类的部分。

27.一种鱼类的生产方法,其包括下述(a)工序:

(a)使权利要求1至25中任一项所述的鱼类与其它鱼类交配的交配工序。

28.一种熟化加速的鱼类的生产方法,其包括使对象鱼类的胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的功能丧失工序。

29.一种鱼肉熟化中的肌苷酸含量的增加方法,

其包括使鱼肉熟化的熟化工序,

所述鱼肉为权利要求1至25中任一项所述的鱼类的鱼肉和/或权利要求21所述的鱼类的可食用部分的鱼肉。

30.一种熟化加速的鱼类的筛选方法,其包括从被检鱼类中选拔胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的被检鱼类来作为熟化加速的鱼类的选拔工序。

31.一种鱼类的生产方法,其包括从被检鱼类中筛选胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的被检鱼类的筛选工序,所述筛选工序通过权利要求30所述的筛选方法来实施。

32.一种鱼类的熟化加速能的检测方法,其包括检测被检鱼类中胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因是否丧失功能的检测工序。

33.一种鱼类的加工食品,其使用权利要求1至25中任一项所述的鱼类。

说明书全文

鱼类、鱼类的生产方法和熟化加速的鱼类的生产方法

技术领域

[0001] 本发明涉及鱼类、鱼类的生产方法和熟化加速的鱼类的生产方法。

背景技术

[0002] 鱼类死亡后,肌肉中的核酸会发生分解。已知随着该过程上述肌肉中的肌苷酸含量会增加(专利文献1)。
[0003] 现有技术文献
[0004] 专利文献
[0005] 专利文献1:日本特开昭61-115499号公报

发明内容

[0006] 发明要解决的问题
[0007] 鱼肉的鲜味起因于肌苷酸,因此在上述鱼类死亡后,通过使其熟化可以增加鲜味。另一方面,上述鱼类死亡后肌肉会变软。因此,现状是难以得到既有嚼头又有鲜味的鱼类。
[0008] 因此,本发明的目的在于,提供可增加或加速熟化时的肌苷酸蓄积的鱼类。
[0009] 用于解决问题的方案
[0010] 为了达到上述目的,本发明的鱼类(以下也称为“第1鱼类”)中,胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能。
[0011] 本发明为本发明的鱼类的部分。
[0012] 本发明的鱼类的生产方法(以下也称为“第1生产方法”)包括下述(a)工序:
[0013] (a)使本发明的鱼类与其它鱼类交配的交配工序。
[0014] 本发明的生产方法为熟化加速的鱼类的生产方法(以下也称为“第2生产方法”),包括:
[0015] 使对象鱼类的胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的功能丧失工序。
[0016] 本发明的增加方法为鱼肉熟化中的肌苷酸含量的增加方法,
[0017] 包括使鱼肉熟化的熟化工序,
[0018] 上述鱼肉为本发明的鱼类的鱼肉和/或本发明的鱼类的可食用部分的鱼肉。
[0019] 本发明的熟化加速的鱼类的筛选方法(以下也称为“筛选方法”)包括从被检鱼类中选拔胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的被检鱼类来作为熟化加速的鱼类的选拔工序。
[0020] 本发明的鱼类的生产方法(以下也称为“第3生产方法”)包括从被检鱼类中筛选胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的被检鱼类的筛选工序,
[0021] 上述筛选工序通过本发明的筛选方法来实施。
[0022] 本发明的鱼类(以下也称为“第2鱼类”)通过本发明的第1生产方法、第2生产方法或第3生产方法而得到。
[0023] 本发明的鱼类的熟化加速能的检测方法(以下也称为“检测方法”)包括检测被检鱼类中胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因是否丧失功能的检测工序。
[0024] 本发明的加工食品使用本发明的鱼类。
[0025] 发明的效果
[0026] 根据本发明,可以提供可增加或加速熟化时的肌苷酸蓄积的鱼类。附图说明
[0027] 图1为示出实施例1中的、nt5e基因丧失功能的鳉鱼的肌苷酸的量的图。
[0028] 图2为示出实施例2中的、nt5e基因丧失功能的真鲷的肌苷酸的量图。
[0029] 图3为示出实施例3中的、nt5e基因丧失功能的罗非鱼的肌苷酸的量和K值的图。
[0030] 图4为示出实施例4中的、nt5e基因丧失功能的牙鲆的肌苷酸的量和K值的图。

具体实施方式

[0031] <定义>
[0032] 本说明书中,“鱼类”是指归入脊椎动物中除四足动物以外的动物群的动物。
[0033] 本说明书中,“功能丧失”是指例如对象基因本来具有的功能下降或丧失的状态。
[0034] 本说明书中,“功能丧失性突变”(loss of function mutation)是指对象基因本来具有的功能(显著)减弱的突变和/或引起功能完全丧失的突变。上述“引起功能完全丧失的突变”例如也可以称为无效突变(null mutation)或无效等位基因(amorph)。
[0035] 本说明书中,“鱼类”是指鱼类的个体。
[0036] 本说明书中,“鱼类的部分”是指鱼类个体的局部或部分。
[0037] 本发明中,“熟化”是指使对象鱼类中的蛋白质分解为基酸的工序或处理。上述熟化例如也可以称为aging。
[0038] 本说明书中,“肌苷酸的分解活性”或“肌苷酸分解活性”是指将肌苷酸分解为肌苷的活性。
[0039] 本说明书中记载的蛋白质或编码该蛋白质的核酸(例如DNA或RNA)的序列信息可从Protein Data Bank、UniProt、Ensembl或GenBank等获得。另外,RNA的核酸序列可使用适当的序列转化软件等由对应的DNA的核酸序列获得。
[0040] <鱼类>
[0041] 一个方式中,本发明提供可增加或加速熟化时的肌苷酸蓄积的鱼类。本发明的鱼类(第1鱼类)中,胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能。
[0042] 本发明人们深入研究的结果是,得到了鱼类的胞外5’-核苷酸酶(NT5E)与鱼类死亡后产生的鲜味成分的含量变动有关的见解。并且,本发明人们进一步研究的结果是,查明了NT5E有助于作为鲜味成分的肌苷酸的分解,发现通过使胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能可以促进肌苷酸的蓄积,从而作出了本发明。根据本发明,与具有野生型的(正常的)nt5e基因的鱼类相比,能够进一步缩短达到一定量的肌苷酸含量所需的时间。通常,鱼类死亡后很快就会变软,口感变软。因此,上述鱼类难以得到既有嚼头又有鲜味的鱼类。另一方面,根据本发明,能够在鱼类死亡后加速鱼肉中的肌苷酸蓄积,因此可期待得到既有嚼头又有鲜味的鱼类。
[0043] 上述鱼类可列举例如鲀科(Tetraodontidae:puffers)、箱鲀科(Ostraciidae:boxfishes)、鲷科(Sparidae:sea breams and porgies)、鲑科(Salmonidae)、鲤科(Cyprinidae)、鮨科(Serranidae:sea basses)、慈鲷科(Cichlidae)、鳉鱼科(Oryziidae:medakas)、牙鲆科(Paralichthys)鲹科(Carangidae)、鲿科(Bagridae)、胡鲇科(Clariidae)、北美鲇科(Intaluridae)等鱼类。
[0044] 上述鲀科的鱼类可列举例如红鳍东方鲀(Takifugurubripes)、紫色红鳍东方鲀(Takifuguporphyreus)、星点红鳍东方鲀(Takifuguniphobles)等红鳍东方鲀属(Takifugu);淡鳍兔头鲀(Lagocephaluswheeleri)等兔头鲀属(Lagocephalus;)等鱼类。
[0045] 上述箱鲀科的鱼类可列举例如无斑箱鲀(Ostracionimmaculatus)等箱鲀属的鱼类。
[0046] 上述鲷科的鱼类可列举例如真鲷(Pagrusmajor)、金赤鲷(Pagrusauratus)等真鲷属(Pagrus);黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)、黄鳍棘鲷(Acanthopagruslatus)等棘鲷(Acanthopagrus)属;黄牙鲷(黄鲷)(Dentextumifrons)等黄牙鲷属(Dentex);大西洋鲷(Sparusaurata)等黄鳍鲷属(Sparus)等鱼类。
[0047] 上述鲑科的鱼类可列举例如麦奇钩吻鳟(Oncorhynchusmykiss)、大鳞鳟(Oncorhynchustshawytscha)、山女鳟(Oncorhynchus masou)、石川苏大马哈鱼(Oncorhynchus masou)、斑点大麻哈鱼(Oncorhynchuskawamurae)、驼背大麻哈鱼(Oncorhynchusgorbuscha)、大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)等太平洋鲑属的鱼类;褐鳟(Salmotrutta)、红鲑(Oncorhynchusnerka)、大麻哈鱼(Oncorhynchuskisutch)、大西洋鲑(Atlantic salmon)(Salmosalar)等大西洋鲑属的鱼类;玛红点鲑(Salvelinusmalma)、白斑红点鲑(Salvelinus leucomaenis)、美洲红点鲑(Salvelinusfontinalis)、突吻红点鲑(Salvelinus namaycush)等红点鲑属的鱼类;远东哲罗鲑(Parahuchoperryi)等哲罗鲑属的鱼类;等。
[0048] 上述鲤科的鱼类可列举例如暗色颌须鮈(Gnathopogoncaerulescens)、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、鳙鱼(Hypophthalmichthysnobilis)、鲫鱼(Carassius carassius)、卡特拉魮(Cyprinuscatla)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、鲮鱼(Cirrhinusmolitorella)、卷须鲮(Cirrhinuscirrhosus)、卡特拉魮(Catlacatla)、南亚野鲮(Labeorohita)、团头鲂(Megalobramaamblycephala)等鱼类。
[0049] 上述鮨科的鱼类可列举例如七带石斑鱼(Epinephelusseptemfasciatus)、褐带石斑鱼(Epinephelusbruneus)、赤点石斑鱼(Epinephelusakaara)、点带石斑鱼(Epinephelusmalabaricus)、石斑鱼(Epinephelus aeneus)、镶点石斑鱼(Epinephelus amblycephalus)、宝石石斑鱼(Epinephelus areolatus)、橙点石斑鱼(Epinephelus bleekeri)、点列石斑鱼(Epinephelus bontoides)、网纹石斑鱼(Epinephelus chlorostigma)、斜带石斑鱼(Epinephelus coiodes)、横带石斑鱼(Epinephelus fasciatus)、褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)、加州石斑鱼(Epinephelus labriformis)、鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)、花点石斑鱼(Epinephelus maculatus)、点带石斑鱼(Epinephelus malabricus)、乌鳍石斑鱼(Epinephelus marginatus)、波纹石斑鱼(Epinephelus ongus)、清石斑鱼(Epinepheluspolyphekadion)、玳瑁石斑鱼(Epinephelus quoyanus)、六带石斑鱼(Epinephelussexfasciatus)、拿骚石斑鱼(Epinephelus striatus)、巨石斑鱼(Epinephelus tauvina)、蓝身大斑石斑鱼(Epinephelus tukula)等石斑鱼属(Epinephelus)、驼背鲈(Cromileptesaltivelis)等驼背鲈属、豹纹鳃棘鲈(Plectropomusleopardus)等鳃棘鲈属(Plectropomus)等鱼类和鮨科鱼类彼此的杂交种。
[0050] 上述慈鲷科(Cichlidae)的鱼类可列举例如尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、罗非鱼(Oreochromismossambicus)、奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)等口孵罗非鱼属(Oreochromis)等鱼类。
[0051] 上述鳉鱼科的鱼类可列举例如鳉鱼(Oryziaslatipes、Oryziassakaizumii)、爪哇青鳉(Oryziasjavanicus)等鳉鱼属(Oryzias)等鱼类。
[0052] 上述牙鲆科的鱼类可列举例如牙鲆(Paralichthysolivaceus)等牙鲆属(Paralichthys)的鱼类。
[0053] 上述鲹科的鱼类可列举例如黄尾鰤(Seriolalalandi)、高体鰤(Seriola dumerili)等鰤属(Seriola)的鱼类。
[0054] 上述鲿科的鱼类可列举例如黄颡鱼(Pseudobagrusfulvidraco)等黄颡鱼属(Pelteobagrus)的鱼类。
[0055] 上述胡鲇科的鱼类可列举例如尖齿胡鲶(Clariasgarienpinus)等胡鲶属(Clarias)的鱼类。
[0056] 上述北美鲇科的鱼类可列举例如北美鲇(Ictaluruspunctatus)等北美鲇属(Ictalurus)的鱼类。
[0057] 本发明中,上述鱼类可以为纯系品种,也可以为杂交品种。上述杂交品种例如可包括源自属间杂交的杂种。
[0058] 本发明中,上述鱼类例如优选为养殖用的鱼类。
[0059] 本发明中,上述鱼类可以为海水鱼,可以为淡水鱼,可以为咸水鱼。
[0060] 本发明中,上述鱼类的生长阶段没有特别限制,可以为例如鱼苗(幼体)、小鱼、未成鱼(幼鱼、稚鱼)和成鱼中任一种。
[0061] 已知上述胞外5’-核苷酸酶(nt5e)是通常具有催化将胞外的5’-核糖核苷酸转化为核糖核苷的化学反应的活性的蛋白质。上述nt5e基因和其同源基因在鱼类中在基因组上存在两种以上。
[0062] 本发明中,上述鱼类的nt5e基因只要是鱼类中存在的编码胞外5’-核苷酸酶的基因(野生型nt5e基因)即可,作为具体例,可列举下述表1所示的nt5e基因。
[0063] 表1
[0064] 种名学名
基因ID(Ensembl)
基因ID(NCBI)


鳉鱼
Oryzias latipes
ENSORLG00000014932
101174549


红鳍东方鲀
Takifugu rubripes
ENSTRUG00000004739
101065733


奥利亚罗非鱼
Oreochromis aureus
ENS0ABG00000015619
-


尼罗罗非鱼
oreochromis niloticus
ENSONIG00000003636
-


大西洋鲷
Sparus aurata
ENSSAUG00010026291
115566087


欧洲鲈
Dicentrarchus labrax
ENSDLAG00005000098
-


黄条鲫
Seriola lalandi dorsalis
ENSSLDG00000003971
111644776


高体鲫
Seriola dumerili
ENSSDUG00000017875
111225877


麦奇钩吻鳟
Oncorhynchus myk iss
ENSOMYG00000034004
110498125


大鳞鳟
Oncorhynchus tshawytscha
ENSOTSG00005034677
112262034


褐鳟
Salmo trutta
ENSSTUG00000051027
115172841


大西洋鲑
Salmo salar
ENSSSAG00000015918
106565054


牙鲆
Paralichthys olivaceus
-
109646855


北美鲇
Ictalurus punctatus
-
108279846


黄颡鱼
Tachysurus fulvidraco
-
113662406
[0065] (-:无相符者)
[0066] 作为具体例,上述鱼类为真鲷、红鳍东方鲀、罗非鱼、麦奇钩吻鳟、暗色颌须牙鲆、革胡子鲶或鳉鱼的情况下,作为上述鱼类的nt5e基因(野生型nt5e基因),可分别例示出下述(Pn)、(Pt)、(Po)、(Pm)、(Pg)、(Pp)、(Pq)和(P1)的多核苷酸、或编码这些的基因组区域。需要说明的是,下述序列号1、3、5、7、9、11、13和25的基序列为包含终止密码子的碱基序列。
[0067] (Pn)下述(Pnl)~(Pn7)中的任一多核苷酸:
[0068] (Pn1)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸;
[0069] (Pn2)由在上述(Pn1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0070] (Pn3)由相对于上述(Pn1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0071] (Pn4)由与由上述(Pn1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0072] (Pn5)由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0073] (Pn6)编码由在序列号2的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0074] (Pn7)编码由相对于序列号2的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0075] 真鲷的nt5e基因的碱基序列(序列号1)
[0076] 5'-ATGGGAGCGCTGCGCCCGCGCTGCCTCCACCTCCTCCTCCTGCT GCTGGGCTTCTCCGTGTCCACCTCGGCGGCCTGGGACCTGGTTCTCCTCCACACCAACGACGTGCACGCCCGGGTGGAGGAGACCAGCAAGCACTCCGGGAAATGCAGCAGCAGCAGGAAGAGCGGCGGGTGTTTCGCCGGAGTGGCCCGCAGAGCCACGATGATCAAGAAGATCCGCTCCACCGACAGCAACGTGCTGCTGCTGGACGCCGGGGACCAGTTCCAGGGCAGCGTGTGGTTCAATTACTACAAGGGAGCCGAGGCTGCTCACTTCATGAACAAACTGCAGTATGATGCCATGGCCTTGGGAAATCACGAGTTCGACAACGGAGTGGAAGGACTCATGAAGCCGTTCATGGAGAAGATCAGGTGTCCTGTTCTGAGCGCCAACATCAAACCTGATGAAGCTATGGCACCGACGTTCAGCAGCTCCTATCTACCTTATAAGATACTGACTGTGGGCAGCGAGAAGGTGGGCGTAGTGGGATACACGTCGCAGGAAACTCCGGCTCTGTCCAGACCTGGACCTCACCTGGAGTTTGAGGACGAGGTGACCTCGCTGCAGCTGCAGGTGAACAAACTGCAGACGCTGGGAGTGAATAAGATCATCGCTCTGGGACACTCCGGCTTCACGGTGGATCGCGAGATCGCCAAGAAGGTCCGCGGAGTCGACGTGGTCATCGGTGGACACACCAACACTTTCCTGTTCACAGGGCATCCTCCCTCCTCTGAGGTCCCGTTGGGTAGTTATCCGTTCATGGTGACATCAGTGGACGGGCGCCAGGTTCCTGTCGTGCAGGCCTACGCCTTTGGAAAATATCTGGGTCACTTGAAAGTGACCTTTGATGATGCTGGAAACGTGATGAAGTCAACAGGAAACCCAATCCTGCTGGACAGCAGCGTCCCACAGGATCCAGATGTTCTTGCTGACGTGGAGGAATGGAAAAAGAGTCTGGCCAACTACTCAGCTCAGGAGGTGGGAAAGACTCTGGTGTTCCTGAACGGGACCACTGAGGAGTGTCGATTTCGAGAATGCAACCTGGGAAACCTGATCTGTGACGCCATGGTCAACAACAACATCCGATTCTTAGAGGACGAGCAGTGGAACCACGTCAGCGCCTCCATCTTCAATGGAGGAGGCATCCGAACATCCATCGATGAGCACAGCAGGAACGGTTCGATCACCATGGAGGACCTGATCTCCGTCTTACCTTTCGGAGGAACCTTCGACCTGGTGCAGCTGAACGGCTCCACGCTGAGGAGAGCTTTCGAGCACTCAGTGAAACGATACGGCGAAAGCACCGGAGAATTTCTCCAAGTGTCCGGTTTCCATGTAGAGTTCGACCTCTCCAAACCGGCTGGTAGTCGCGTGAGGAGCCTCGACATCCTCTGCACTCAGTGTCGAGTCCCTCAATACGAACCCGTGGAGGATGAGACGGTTTACACAGTGGTGGTGCCGTCCTTCATGGTGACAGGCGGAGACGGATACTCCATGATCAGGAATGAGACGCTCAAACACAACAGCGGTAATCTGGACATTTCAGTCGTGTCCAACTACATCATGCAGAGAAAGAGAGTTTATCCGGCTGTTGAAGGACGAATCAAGATCTACAACTCAGCTTCTGGACCGCGAGGACAAATTTTACTGGTTTCACTGGTGCTGCTCTGGACTCTGTGGGAGCATGTAGGAGTGACTTCAACCAGTTTTTAA-3'
[0077] 上述(Pn1)中,序列号1的碱基序列为编码上述(Pn5)的氨基酸序列的碱基序列。上述序列号1的碱基序列例如可以由真鲷(Pagrusmajor)得到。
[0078] 上述(Pn2)中,“1或多个”例如为上述(Pn2)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pn2)的“1或多个”为上述(Pn1)的碱基序列中的例如1~351个、1~263个、1~175个、1~87个、1~70个、1~52个、1~35个、1~17个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。本发明中,碱基数或氨基酸数等个数的数值范围公开了例如属于该范围的全部正整数。即,例如“1~5个”这种记载意味着公开了“1、2、3、4、5个”的全部(以下也同样)。
[0079] 上述(Pn3)中,“同一性”例如为上述(Pn3)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pn3)的同一性相对于上述(Pn1)的碱基序列为例如80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。上述“同一性”可以通过对2个碱基序列或氨基酸序列进行比对而求出(以下也同样)。上述比对例如可以使用BLAST、FASTA等通过默认的参数来计算。
[0080] 上述(Pn4)中,“杂交的多核苷酸”为上述(Pn4)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pn4)中,“杂交的多核苷酸”例如为与上述(Pn1)的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述杂交例如可以通过各种杂交试验来检测。上述杂交试验没有特别限制,可以采用例如Sambrook等编撰的“Molecular Cloning:ALaboratory Manual 2nd Ed.”〔Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)〕等中记载的方法。
[0081] 上述(Pn4)中,“严谨条件”例如可以为低严谨条件、中严谨条件、高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”例如为5×SSC、5×邓哈特溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、32℃的条件。“中严谨条件”例如为5×SSC、5×邓哈特溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”例如为5×SSC、5×邓哈特溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、50℃的条件。严谨性的程度可以由本领域技术人员通过适当选择例如温度、盐浓度、探针的浓度和长度、离子强度、时间等条件来设定。“严谨条件”例如可以采用上述Sambrook等编撰的“Molecular Cloning:ALaboratory Manual 2nd Ed.”〔Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)〕等中记载的条件。
[0082] 上述(Pn5)的多核苷酸例如为上述(Pn5)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的碱基序列即可。上述(Pn5)的多核苷酸的碱基序列例如可以通过基于上述序列号2的氨基酸序列置换为对应的密码子来设计。
[0083] 真鲷的NT5E蛋白的氨基酸序列(序列号2)
[0084] MGALRPRCLHLLLLLLGFSVSTSAAWDLVLLHTNDVHARVEETSKHSGKCSSSRKSGGCFAGVARRATMIKKIRSTDSNVLLLDAGDQFQGSVWFNYYKGAEAAHFMNKLQYDAMALGNHEFDNGVEGLMKPFMEKIRCPVLSANIKPDEAMAPTFSSSYLPYKILTVGSEKVGVVGYTSQETPALSRPGPHLEFEDEVTSLQLQVNKLQTLGVNKIIALGHSGFTVDREIAKKVRGVDVVIGGHTNTFLFTGHPPSSEVPLGSYPFMVTSVDGRQVPVVQAYAFGKYLGHLKVTFDDAGNVMKSTGNPILLDSSVPQDPDVLADVEEWKKSLANYSAQEVGKTLVFLNGTTEECRFRECNLGNLICDAMVNNNIRFLEDEQWNHVSASIFNGGGIRTSIDEHSRNGSITMEDLISVLPFGGTFDLVQLNGSTLRRAFEHSVKRYGESTGEFLQVSGFHVEFDLSKPAGSRVRSLDILCTQCRVPQYEPVEDETVYTVVVPSFMVTGGDGYSMIRNETLKHNSGNLDISVVSNYIMQRKRVYPAVEGRIKIYNSASGPRGQILLVSLVLLWTLWEHVGVTSTSF
[0085] 上述(Pn6)中,关于氨基酸序列的“1或多个”例如为上述(Pn6)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pn6)的“1或多个”例如为上述序列号2的氨基酸序列中的例如1~116个、1~86个、1~58个、1~29个、1~23个、1~17个、1~11个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0086] 上述(Pn7)中,关于氨基酸序列的“同一性”例如为上述(Pn7)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pn7)的同一性相对于上述序列号2的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0087] (Pt)下述(Pt1)~(Pt7)中的任一多核苷酸:
[0088] (Pt1)由序列号3的碱基序列构成的多核苷酸;
[0089] (Pt2)由在上述(Pt1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0090] (Pt3)由相对于上述(Pt1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0091] (Pt4)由与由上述(Pt1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0092] (Pt5)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0093] (Pt6)编码由在序列号4的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0094] (Pt7)编码由相对于序列号4的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0095] 红鳍东方鲀的nt5e基因的碱基序列(序列号3)
[0096] 5'-ATGAGCGTGTGGTCGCGCCGGTGCGCTCTCTGGGTCTGCATCTC TCTACTGGCGGGGCCAGTTTGGACCTTCGAGCTGACGCTGCTTCACACCAACGACAACCATGCGCGGATCGAGGAGACCAGCGAGGACTTGGGAAAGTGCTCATCCAGGGGTCCCTGTTTCGCGGGGGTCGCCCGGAGGTTCACCAAAGTGTCGGAGATCCGCAAAAAGGAAAAGAACGTTTTGTTCCTGGACGCTGGGGACCAATTTCAGGGGACGGTTTGGTTTAACTACTACAAAGGCGCAGAAGCCGCGCACTTTATGAATAAACTTGGTTATAATGCGATGGCTTTAGGGAACCATGAGTTTGATAATGGGGTGGAGGGACTCCTGCCTTTCCTCCAGAATGTGAACTGTTCTGTGGTGAGTGCGAACATCCAACCTGACCAGAGTCTGGCTGCAAAGCTCAGCGGTTTCCTCCAGCCCTACACGGTCCTCAACGTGGGCTCAGAGAAGGTGGCCGTGGTGGGCTACACCACCGCCGAGACCCCCTTCCTATCTATGCCAGGCCCACATCTTAAATTTAACGAGGAAGTGGAGGCGCTCCAGGTCCAGGTGGACAAACTGGAAACCCTGGGTTATGATAAGATCATCGCCTTGGGTCACTCCGGCTTTGATGTGGATCAGCAGATCGCCAAGCGAGTGAGAGGGGTTGACGTCGTCATCGGAGGACACACCAACACCTTCCTTTATACTGGAAAAGCCCCGTCCACTGAAGTGCCTGTAGGTCCTTATCCTTTTATAGTGAGGTCTGACGATGGGAGAAACGTCCCGGTGGTCCAAGCTTTTGCCTTTGGAAAATACCTCGGTTACTTGAGGGTCACATTTGACGATGCTGGAAAAGTAATCAAGGCTGCAGGAAACCCAATCCTACTGGACAGCAGCGTCCCTCAGGATCCGGACGTCCTGGCTGAGGTCAACAGGTGGAAGAAAGACCTGGCTCAGTACTCCTCACAGTATGTCGGGCAAACCTTAGTTTATCTCAACGGCACGTTTGAAGAGTGCCGATTTCGGGAGTGTAACCTCGGCAACCTGATCTGCGATGGCATGATCGACCACAACATCAAATTCTCCAGCGAGCTGCAGTGGAACCACGTGAGCCTTTGTATGCTGAACAGCGGAGCCATACGGGCTCCCATCGATGAGCGCTACAAGAACGGCTCCATAACTATGGAGGACGTCCTCACTGTCTTGCCGTTCGGAGGGACTGTTGACTTGGTGCAGATAAAAGGGTCAACGGTGAAGAAGGCGTTCGAACATGCCGTCCACAGATTTGGAAGCATGTCAGGAGAGTTTCTGCAAGTCTCAGGCTTCCATGTCAAGTACGACCTGTCCAAACCAGTGAACCAACGCGTCACGTCTCTGTCGGCACTTTGCACTGAGTGCCGCGTACCCAAATATGAGCCCATAGACCCGGAGAGGACGTACAAGGTGACCATGCCGTCATATCTGGTGGACGGTGGTGACGGTTTCAGCATGATCAAGGAGGAGTTACTGAAGCATAACACAGGTGACTTGGACATTTCTGTGTTCTCTAAATATATCTCGCAGCAGAAGCGCGTATATCCAGCAGTGGAGGGCCGGATCACAGTCAGGGGCTCGGCCTCCTCTGCAGCCCACAGCCTCGACGTATTCCTTCATACTTGGCCTCTTCTCCCATACATTTCCCCAGGAAGTCTGAAAGATAAATGGCTATAG-3'
[0097] 上述(Pt1)中,序列号3的碱基序列为编码上述(Pt5)的氨基酸序列的碱基序列。上述序列号3的碱基序列例如可以由红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)得到。
[0098] 上述(Pt2)中,“1或多个”例如为上述(Pt2)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pt2)的“1或多个”为上述(Pt1)的碱基序列中的例如1~348个、1~261个、1~174个、1~87个、1~69个、1~52个、1~34个、1~17个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0099] 上述(Pt3)中,“同一性”例如为上述(Pt3)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pt3)的同一性相对于上述(Pt1)的碱基序列为例如80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0100] 上述(Pt4)中,“杂交的多核苷酸”为上述(Pt4)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pt4)中,“杂交的多核苷酸”例如为与上述(Pt1)的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(Pt4)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0101] 上述(Pt5)的多核苷酸例如为上述(Pt5)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的碱基序列即可。上述(Pt5)的多核苷酸的碱基序列例如可以通过基于上述序列号4的氨基酸序列置换为对应的密码子而设计。
[0102] 红鳍东方鲀的NT5E蛋白的氨基酸序列(序列号4)
[0103] MSVWSRRCALWVCISLLAGPVWTFELTLLHTNDNHARIEETSEDLGKCSSRGPCFAGVARRFTKVSEIRKKEKNVLFLDAGDQFQGTVWFNYYKGAEAAHFMNKLGYNAMALGNHEFDNGVEGLLPFLQNVNCSVVSANIQPDQSLAAKLSGFLQPYTVLNVGSEKVAVVGYTTAETPFLSMPGPHLKFNEEVEALQVQVDKLETLGYDKIIALGHSGFDVDQQIAKRVRGVDVVIGGHTNTFLYTGKAPSTEVPVGPYPFIVRSDDGRNVPVVQAFAFGKYLGYLRVTFDDAGKVIKAAGNPILLDSSVPQDPDVLAEVNRWKKDLAQYSSQYVGQTLVYLNGTFEECRFRECNLGNLICDGMIDHNIKFSSELQWNHVSLCMLNSGAIRAPIDERYKNGSITMEDVLTVLPFGGTVDLVQIKGSTVKKAFEHAVHRFGSMSGEFLQVSGFHVKYDLSKPVNQRVTSLSALCTECRVPKYEPIDPERTYKVTMPSYLVDGGDGFSMIKEELLKHNTGDLDISVFSKYISQQKRVYPAVEGRITVRGSASSAAHSLDVFLHTWPLLPYISPGSLKDKWL
[0104] 上述(Pt6)中,关于氨基酸序列的“1或多个”例如为上述(Pt6)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pt6)的“1或多个”例如为上述序列号4的氨基酸序列中的例如1~115个、1~86个、1~57个、1~28个、1~23个、1~17个、1~11个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0105] 上述(Pt7)中,关于氨基酸序列的“同一性”例如为上述(Pt7)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pt7)的同一性相对于上述序列号4的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0106] (Po)下述(Po1)~(Po7)中的任一多核苷酸:
[0107] (Po1)由序列号5的碱基序列构成的多核苷酸;
[0108] (Po2)由在上述(Po1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0109] (Po3)由相对于上述(Po1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0110] (Po4)由与由上述(Po1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0111] (Po5)编码由序列号6的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0112] (Po6)编码由在序列号6的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0113] (Po7)编码由相对于序列号6的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0114] 罗非鱼的nt5e基因的碱基序列(序列号5)
[0115] 5'-ATGTGCTATACATTCTTGGTCACAAATGCGTTTTTTACGCACGGAGACATCATGGGTTTCCGTTCGTCTCGGCGCGCTCTCTTGACCTCGCTCTGCCTCGTTTTAAACTGCTGGAGCGGAGCGTCGACCTTCGAGCTGACAATACTCCACACCAATGACAACCATGCGCGAATCGAGGAGACCGGCAAGGACTCGGGAAAGTGTCGACCCGAGCGTCCCTGCTTCGCTGGTGTGGCCAGGAGGTTCACGAAAGTGACCGAGATCAGAACAAAAGAGACGAACGTGGTGTTTCTGGATGCTGGAGACCAATTCCAAGGGACACTCTGGTTCAACTACTATAAAGGCGCTGAAGCCGCACACTTTATGAACAAACTTTGTTATGATGTTATGGCTTTTGGAAATCACGAGTTTGACAATGGAGTGGAGGGTCTCATTCACCCCTTCCTCCAAAATATAAATTTCTCTGTGGTCAGTGCAAACATTAAACCCGACTACACCCTGGCAGAGCTTCATAAATACTACAGTCCCTACAAAGTTATCAGTGTGGGCTCAGAGAAAGTGGCTGTGGTTGGCTATACCTCAGCAGAGACGCCCTTCTTATCCATGCCAGGCAAACATCTCAAGTTCGAAGATGAGGTGGAGTCACTTCAAGCTCAAGTAAATAAGCTGGAAAGTCTGGGCTATAATAAAATCATTGCCCTGGGACACTCTGGTTTTGTTGTGGATCAAGACATCGCAAGACGCGTGAGAGGGGTGGACGTTGTTGTTGGAGGGCATACCAACACGTTCCTCTACACAGGAACGCCCCCATCTTCCGAAGTGCCAGCTGGCCCATATCCTTTTATAGTAAAATCCAGCCATGGAAGAGATGTGCCAGTGGTCCAGGCTTACGCCTTTGGGAAATATCTTGGACACTTAAAAGTCACCTTTGATGATGCTGGCAATGTCATCAAAGCCGTTGGAAATCCCATCCTAATGGACAGCAGCATACCTCAAGATGCAGAGATCCTTGCTGATGTTAATAAGTGGAAAACAGACTTGGCTCAATACTCGACTAAGTATGTGGGCCAAACCTTAGTCTACCTCAACGGGTCATTTGAAGAGTGCCGATTTCGGGAGTGTAACCTGGGAAACCTAATCTGTGATGCCATGGTGTATCACAATATGAGGCATTCAACTGGGGAGCAGTGGAATCATGTAAGCCTGTGTATGCTGAATAGTGGGGGCATACGGACAGCGATAGACGAACGCTACAGAAATGGCTCCATAACAATGGAGGAGATCCTCACCGTGTTACCATTTGGAGGAACCTGCGACTTGGTCCAAATAAAAGGCTCAACAATAAAAAAGGCATTTGAACACTCTGTTCACAGATATGGAAGCAAGACTGGAGAATTTCTTCAGGTGGTTTACGACCTCTCTAAGCCAGTGAACCAGCGTGTAGCATCGCTGTCATTGCTCTGCACAGAGTGCCGAGTGCCCAAGTATGAACCATTAGACCCACAGAAGACCTACACCGTGGTCATGCCTTCATACATGGTGGGCGGAGGCGATAACTTTACAATGATTAAGAGGGAGTTACTGAAACATAATTCAGGTGACTTGGACATTACCGTTTTTTCCAAGTACATCTCCGACATGAAGCGCGTGTTCCCTGCAGTAGAAGGCCGCATCACTTTCAGGAACTCTGCTGTCATTGCTTCATACAGTATTGGCTTGTTGCTGCTGAGTCTGTGTCTGTCTGTGACACTTTGA-3'
[0116] 上述(Po1)中,序列号5的碱基序列为编码上述(Po5)的氨基酸序列的碱基序列。上述序列号5的碱基序列例如可以由罗非鱼(Oreochromis niloticus)得到。
[0117] 上述(Po2)中,“1或多个”例如为上述(Po2)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Po2)的“1或多个”为上述(Po1)的碱基序列中的例如1~351个、1~263个、1~175个、1~87个、1~70个、1~52个、1~35个、1~17个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0118] 上述(Po3)中,“同一性”例如为上述(Po3)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Po3)的同一性相对于上述(Po1)的碱基序列为例如80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0119] 上述(Po4)中,“杂交的多核苷酸”为上述(Po4)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Po4)中,“杂交的多核苷酸”例如为与上述(Po1)的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(Po4)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0120] 上述(Po5)的多核苷酸例如为上述(Po5)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的碱基序列即可。上述(Po5)的多核苷酸的碱基序列例如可以通过基于上述序列号6的氨基酸序列置换为对应的密码子而设计。
[0121] 罗非鱼的NT5E蛋白的氨基酸序列(序列号6)
[0122] MCYTFLVTNAFFTHGDIMGFRSSRRALLTSLCLVLNCWSGASTFELTILHTNDNHARIEETGKDSGKCRPERPCFAGVARRFTKVTEIRTKETNVVFLDAGDQFQGTLWFNYYKGAEAAHFMNKLCYDVMAFGNHEFDNGVEGLIHPFLQNINFSVVSANIKPDYTLAELHKYYSPYKVISVGSEKVAVVGYTSAETPFLSMPGKHLKFEDEVESLQAQVNKLESLGYNKIIALGHSGFVVDQDIARRVRGVDVVVGGHTNTFLYTGTPPSSEVPAGPYPFIVKSSHGRDVPVVQAYAFGKYLGHLKVTFDDAGNVIKAVGNPILMDSSIPQDAEILADVNKWKTDLAQYSTKYVGQTLVYLNGSFEECRFRECNLGNLICDAMVYHNMRHSTGEQWNHVSLCMLNSGGIRTAIDERYRNGSITMEEILTVLPFGGTCDLVQIKGSTIKKAFEHSVHRYGSKTGEFLQVVYDLSKPVNQRVASLSLLCTECRVPKYEPLDPQKTYTVVMPSYMVGGGDNFTMIKRELLKHNSGDLDITVFSKYISDMKRVFPAVEGRITFRNSAVIASYSIGLLLLSLCLSVTL
[0123] 上述(Po6)中,关于氨基酸序列的“1或多个”例如为上述(Po6)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Po6)的“1或多个”例如为上述序列号6的氨基酸序列中的例如1~116个、1~87个、1~58个、1~29个、1~23个、1~17个、1~11个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0124] 上述(Po7)中,关于氨基酸序列的“同一性”例如为上述(Po7)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Po7)的同一性相对于上述序列号6的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0125] (Pm)下述(Pm1)~(Pm7)中的任一多核苷酸:
[0126] (Pm1)由序列号7的碱基序列构成的多核苷酸;
[0127] (Pm2)由在上述(Pm1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0128] (Pm3)由相对于上述(Pm1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0129] (Pm4)由与由上述(Pm1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0130] (Pm5)编码由序列号8的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0131] (Pm6)编码由在序列号8的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0132] (Pm7)编码由相对于序列号8的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0133] 麦奇钩吻鳟的nt5e基因的碱基序列(序列号7)
[0134] 5'-ATGAAAAAGGGTAACCAGCATATAATGTATGCGCCTAAAATTATT CCCAATGTTTTGGTCGCTTTCCTTTCCCTAGCGGCTGAGATTCTTTTTTTCTCCAAAAGTGCGTCAGACACGGTTACTTTCACTTGGTTCTCACTTGCCGAGGAACCCGTGTCACCGGAGTGGGTATCATGTCTTCCACACTGCAAAGGTGATGTCGATGCCACAGATCCAGGGGAGTTCGTGACCAGGCGCGCTGAAGCATTTGGAAACCATGAGTTTGACAATGGAGTGGAGGGCCTGCTCCGCCCTTTTCTGCAGAAGGTGAACTTCACTGTTCTCAGTGCCAACATCAAGGCAGATGCAACACTCGCCCCAACTATCAATGGTTACTATCAACCCTACACAACATTCACGATGGGCTCTGAAATAGTGGCTGTGGTAGGTTACACCTCAGTGGAAACTCCAGTCTTATCCTTACCAGGTCCACACCTGATCTTTGAGGATGAGATCAAAGCCTTGCAGGTCCAGGTGGATAAACTGATCACTCTTGGTTACAATAAGATCATCGCCCTTGGTCACTCTGGATTTGACGTGGATATAGACATCGCCAAGCGAGTGAAAGGCGTGGACCTGGTCATCGGCGGACACACCAACACTTTCCTCTACACCGGGAGTGTCCCATCTTCAGAGGTGCCGGCGGGTCCCTACCCCTTCACGGTGAGGTCTGAGGACGGGAGAGATGTCCCTGTGGTACAGGCTTTTGCCTTTGGGAAGTACCTGGGATACCTCAAGTTGGTCTTCGATAAATCTGGGAACGTGCTGAAGGCGAATGGAAACCCCATCCTGCTGGACAGCAGCATAGCCCAGGATCCAGGTATCCTTGCTGATGTTGACGAGTGGAAGAAGAACTTGGCCCAGTACTCGTCTCAGTACGTGGGGAAAACCCTGGTGTATCTCAATGGAACCTTCAATGAGTGCCGGTTCCGAGAGTGCAACCTGGGGAACCTCATCTGTGACGCAATGATTCATCACAATATCAAGTATGCAGATGAGATCCAGTGGAATCACGTCAGTTTATGCATCCTGAACAGTGGAGGCATAAGGACAGGAATAGATGAAAGTCACAAAAATGGCACCATCACCATGGAGGAAGTTATATCAGTCTTACCATTTGGGGGCACTTTTGATCTGGTGCAGTTGAAGGGATCAACCTTGAAAAAGGCATTTGAAAACTCTGTCCGAAGATACGGGAGCAGCAGAGGAGAATTTCTTCAAGTTTCAGGAATCCATGTGGAATACGACCTGTCACGGTCGGTGGGGGACCGTGTGACGTCCTTGAGCCTCCGCTGCTCTCAGTGCCGTGTGCCCAGATACGAATCTCTGGACCCAGACAGGCTGTACAAGCTGGTCCTACCATCCTACATCGCAGACGGAGGAGATGGTTTTACCATGATTAAGGAGGAGAAACTGAAACATGACACTGGTGATCTGGACATCTCGGTTTTCGCCAACTACATCAAGGAGATGAAGAGGGTGTACCCAACTGTGGAGGGCCGCATCAAGTTCAGAAACTCATCCGTGGCGGCTGGGGCCAACTGTCTGACTTTGTTACTGCTAGGCCTGATGTGGGCCCTGTCCACAAGTTTATGA-3'
[0135] 上述(Pm1)中,序列号7的碱基序列为编码上述(Pm5)的氨基酸序列的碱基序列。上述序列号7的碱基序列例如可以由麦奇钩吻鳟(Oncorhynchus mykiss)得到。
[0136] 上述(Pm2)中,“1或多个”例如为上述(Pm2)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pm2)的“1或多个”为上述(Pm1)的碱基序列中的例如1~327个、1~245个、1~163个、1~81个、1~65个、1~49个、1~32个、1~16个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0137] 上述(Pm3)中,“同一性”例如为上述(Pm3)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pm3)的同一性相对于上述(Pm1)的碱基序列为例如80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0138] 上述(Pm4)中,“杂交的多核苷酸”为上述(Pm4)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pm4)中,“杂交的多核苷酸”例如为与上述(Pm1)的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(Pm4)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0139] 上述(Pm5)的多核苷酸例如为上述(Pm5)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的碱基序列即可。上述(Pm5)的多核苷酸的碱基序列例如可以通过基于上述序列号8的氨基酸序列置换为对应的密码子而设计。
[0140] 麦奇钩吻鳟的NT5E蛋白的氨基酸序列(序列号8)
[0141] MKKGNQHIMYAPKIIPNVLVAFLSLAAEILFFSKSASDTVTFTWFSLAEEPVSPEWVSCLPHCKGDVDATDPGEFVTRRAEAFGNHEFDNGVEGLLRPFLQKVNFTVLSANIKADATLAPTINGYYQPYTTFTMGSEIVAVVGYTSVETPVLSLPGPHLIFEDEIKALQVQVDKLITLGYNKIIALGHSGFDVDIDIAKRVKGVDLVIGGHTNTFLYTGSVPSSEVPAGPYPFTVRSEDGRDVPVVQAFAFGKYLGYLKLVFDKSGNVLKANGNPILLDSSIAQDPGILADVDEWKKNLAQYSSQYVGKTLVYLNGTFNECRFRECNLGNLICDAMIHHNIKYADEIQWNHVSLCILNSGGIRTGIDESHKNGTITMEEVISVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFENSVRRYGSSRGEFLQVSGIHVEYDLSRSVGDRVTSLSLRCSQCRVPRYESLDPDRLYKLVLPSYIADGGDGFTMIKEEKLKHDTGDLDISVFANYIKEMKRVYPTVEGRIKFRNSSVAAGANCLTLLLLGLMWALSTSL
[0142] 上述(Pm6)中,关于氨基酸序列的“1或多个”例如为上述(Pm6)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pm6)的“1或多个”例如为上述序列号8的氨基酸序列中的例如1~108个、1~81个、1~54个、1~27个、1~21个、1~16个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0143] 上述(Pm7)中,关于氨基酸序列的“同一性”例如为上述(Pm7)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pm7)的同一性相对于上述序列号8的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0144] (Pg)下述(Pg1)~(Pg7)中的任一多核苷酸:
[0145] (Pg1)由序列号9的碱基序列构成的多核苷酸;
[0146] (Pg2)由在上述(Pg1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0147] (Pg3)由相对于上述(Pg1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0148] (Pg4)由与由上述(Pg1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0149] (Pg5)编码由序列号10的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0150] (Pg6)编码由在序列号10的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0151] (Pg7)编码由相对于序列号10的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0152] 暗色颌须鮈的nt5e基因的碱基序列(序列号9)
[0153] 5’-ATGATGGCACAGTGGCTCAGCTCCATAAGCCTCCTCTGGATTCA CTGTCAGCTGTGCAGGACTGCGGAGTTCGAGCTGACTTTACTCCACACGAATGATGTCCACGCACGAGTGGAGGAGACCAATAAAGACTCGGGGAAGTGCAGTAAAGCGCCTTGTTTCGCTGGAGTCGCTCGGAGGTTGACGAAGATCAGGGAAGTCCGAGCCCAGGAGAAACACGTTCTGCTGCTGGACGCGGGAGACCAGTTCCAGGGCACCGTCTGGTTTAACTTTTACAAAGGCGCAGAAGCGGCGTATTTCATGAATAAACTCGGATACAATGCGATGGCCTTAGGAAATCATGAGTTTGACAATGGAGTGGACGGCCTCGTGAAACCTTTCCTTCAGGAAGTGAACTGCTCTGTTCTGAGCGCAAATATTAAAGCCGATCAGACAATCGCTCCTCGGATCAGCGGCTACTATCTCCCCTATAAAATCTTCAATTTCACCTCAGAGAAAGTAGGTGTTGTTGGCTACACATCCGTGGAGACCCCGGCTTTGTCTCTGCCAGGCCCCCATCTCCAGTTTGAGGATGAGGTTACTGCTTTACAGCTTCAAGTGGACAAACTCACTGCTTTGGGTGTTAATAAGATCATTGCCCTTGGACATTCTGGCTTCCTAACGGACAAAAAGATCGCAAAGAAAGTTCGGGGAGTGGATGTTGTGATTGGAGGGCACACCAATACATTCTTGTTCACAGGAGAGCCACCATCCACAGAGGTTCCCGCAGGACCGTACCCATTCATGGTGGATTCTGAGGATGGCCGACAGGTTCCCGTGGTCCAGGCCTATGCATTTGGAAAATATCTGGGATTCCTAAAAGTGACTTTTGATTCAAATGGGAATGTGGTGAAATCTTTTGGCAACCCAATTCTTCTGAATGGCTCAGTAGCACCAGATCCAGTCATTCAGGCTGAAGTGGACAACTGGAGGAAGAATCTGGCCAATTACTCTTCTCAGTATGTAGGAGAGACTCTCGTCTATCTCAATGGGACTTTTGAGGAATGCCGATTTCGTGAATGTAATTTGGGAAATTTAATCTGTGATGCAATGGTTCATAATAATATTAAATATGCTGATGAAATCCAGTGGAACCATGTCAGCTCTTGTATTCTGAACGGTGGAGCCATTCGATCACCTATTGATGAGCGAAACAGAAATGGTTCCATCACGATGGAGGACCTGATCGCTGTCCTGCCGTTTGGAGGCACGTTTGACCTGGTCCAAATGAACGGATCTACTCTGCGAGAGGTCTTTGAGCACTCAGTTCGCAGATACGGAGGAAACACTGGAGAATTCCTACAGGTGTCAGGGTTTCAGCTGGTGTTTGATTTATCGAAACCGCCAGGAAGCCGTGTTAAAAGTGTGAACGCGCTCTGCACGGAGTGTCGAGTGCCCCGCTATGAACCGCTCATCCCCACGAAGGTGTATAAAGTGGTGCTGCCCTCTTACCTAGTGGACGGAGGAGACGGATACACCATGATCAAAGAACAGAAACTCAAACATGACAGTGGTGACCTGGATATAGCCGTAGTTGCCAGCTATATCACAGAGAGAAAGAGAGTTCATCCAGCCGTGGAAGGACGCATTCAGTTTTCCAGCTCTTGCATTGCACATCGAGGATACACGGCCATCGTTCTGCTGGTGTGGGCGCTCTGGGTCATGATTGTTTAG-3'
[0154] 上述(Pg1)中,序列号9的碱基序列为编码上述(Pg5)的氨基酸序列的碱基序列。上述序列号9的碱基序列例如可以由暗色颌须鮈(Gnathopogon caerulescens)得到。
[0155] 上述(Pg2)中,“1或多个”例如为上述(Pg2)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pg2)的“1或多个”为上述(Pg1)的碱基序列中的例如1~342个、1~256个、1~171个、1~85个、1~68个、1~51个、1~34个、1~17个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0156] 上述(Pg3)中,“同一性”例如为上述(Pg3)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pg3)的同一性相对于上述(Pg1)的碱基序列为例如80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0157] 上述(Pg4)中,“杂交的多核苷酸”为上述(Pg4)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pg4)中,“杂交的多核苷酸”例如为与上述(Pg1)的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(Pg4)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0158] 上述(Pg5)的多核苷酸例如为上述(Pg5)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的碱基序列即可。上述(Pg5)的多核苷酸的碱基序列例如可以通过基于上述序列号10的氨基酸序列置换为对应的密码子而设计。
[0159] 暗色颌须鮈的NT5E蛋白的氨基酸序列(序列号10)
[0160] MMAQWLSSISLLWIHCQLCRTAEFELTLLHTNDVHARVEETNKDSGKCSKAPCFAGVARRLTKIREVRAQEKHVLLLDAGDQFQGTVWFNFYKGAEAAYFMNKLGYNAMALGNHEFDNGVDGLVKPFLQEVNCSVLSANIKADQTIAPRISGYYLPYKIFNFTSEKVGVVGYTSVETPALSLPGPHLQFEDEVTALQLQVDKLTALGVNKIIALGHSGFLTDKKIAKKVRGVDVVIGGHTNTFLFTGEPPSTEVPAGPYPFMVDSEDGRQVPVVQAYAFGKYLGFLKVTFDSNGNVVKSFGNPILLNGSVAPDPVIQAEVDNWRKNLANYSSQYVGETLVYLNGTFEECRFRECNLGNLICDAMVHNNIKYADEIQWNHVSSCILNGGAIRSPIDERNRNGSITMEDLIAVLPFGGTFDLVQMNGSTLREVFEHSVRRYGGNTGEFLQVSGFQLVFDLSKPPGSRVKSVNALCTECRVPRYEPLIPTKVYKVVLPSYLVDGGDGYTMIKEQKLKHDSGDLDIAVVASYITERKRVHPAVEGRIQFSSSCIAHRGYTAIVLLVWALWVMIV
[0161] 上述(Pg6)中,关于氨基酸序列的“1或多个”例如为上述(Pg6)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pg6)的“1或多个”例如为上述序列号10的氨基酸序列中的例如1~114个、1~85个、1~57个、1~28个、1~22个、1~17个、1~11个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0162] 上述(Pg7)中,关于氨基酸序列的“同一性”例如为上述(Pg7)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pg7)的同一性相对于上述序列号10的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0163] (Pp)下述(Pp1)~(Pp7)中的任一多核苷酸:
[0164] (Pp1)由序列号11的碱基序列构成的多核苷酸;
[0165] (Pp2)由在上述(Pp1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0166] (Pp3)由相对于上述(Pp1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0167] (Pp4)由与由上述(Pp1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0168] (Pp5)编码由序列号12的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0169] (Pp6)编码由在序列号12的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0170] (Pp7)编码由相对于序列号12的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0171] 牙鲆的nt5e基因的碱基序列(序列号11)
[0172] 5’-TCAGGACCTCACCTGAGGTTCGAGGACGAGGTGGACGCTCTGC AGCCACATGTGGACAAGCTGCGGACGCTGGGAGTGGATAAGATCATCGCTCTGGGTCACTCTGGTTTCACCAAGGACCAGGAGATCGCTAAGAAGGTCCGCGGAGTGGACGTGGTCATCGGAGGACACACCAACACGTTCCTCTACACAGGAACTCCTCCCTCATCGGAAGTCCCCGCAGGTCCGTATCCCTTTCTGGTGAAATCGGACGACGGGCGGCAGGTTCCCGTTGTGCAGGCCTACGCCTTCGGAAAATATCTGGGATATCTGAAAGTGACCTTTGACGATGCTGGAAACGTGGAGAGGGCCACAGGAAACCCCATCCTGCTGAACAGCAGCTTCCCGCAGGACCCAGATGTTCTGGCTGATGTGGAGAAATGGAAGAAGAATCTGGCAAACTACTCGGCTCAGGTTGTGGGACAGACTCTGGTCTTCCTGAACGGAGAAAGCGAGGAGTGTCGTTTCCGGGAGTGTAACCTGGGAAACCTGATCTGTGACGCCATGGTCGACAACAACATCCGCATCCCTGACGACGTCCAGTGGAACCACGTCAGCGCCAGCATCTTCAACGGAGGCGGCGTCCGGGCGTCCATCGACGAGCAGTCCAGGAACGGTTCCATCACCATGGAGGACCTGATCTCCGTCTTACCGTTCGGAGGAACCTTCGACCTGGTGCAGCTGAGGGGCTCCACGCTGAGGAAAGCGTTCGAACACTCAGTGAGACGATACGGACAGAGCACCGGAGAATTCCTCCAAGTGTCCGGATTTCACGTAGAGTTCGATCTCTCCAAACCTCCAGGACGTCGTGTGACGAGCCTCCGCATCCTCTGCACAGAGTGTCGCGTCCCTCACTACCAACCGGTGGAGGACGAGACGGTTTACACGGTGGTGCTGACGTCCTACATGGTGAAGGGCGGGGACGGATTCGACATGATCCAAAACGAGATTGTCAAGTACAACAGCGGAGATCTGGACATTTCAGTCGTTTCCAGGTTCATCGGGAAGAGAAAGAAAGTTTATCCTCCTGTCGAAGGACGAATCAGGATCAAGAACTCTGCGTCGAGGCTGCAGGGACGAGCTGCTCTGCTGGTTTCACTGTCGCTGCTCTGGAGTGTGTGCGGGACCATGTGA-3'
[0173] 上述(Pp1)中,序列号11的碱基序列为编码上述(Pp5)的氨基酸序列的碱基序列。上述序列号11的碱基序列例如可以由牙鲆(Paralichthys olivaceus)得到。
[0174] 上述(Pp2)中,“1或多个”例如为上述(Pp2)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pp2)的“1或多个”为上述(Pp1)的碱基序列中的例如1~234个、1~175个、1~117个、1~58个、1~47个、1~35个、1~23个、1~11个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0175] 上述(Pp3)中,“同一性”例如为上述(Pp3)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pp3)的同一性相对于上述(Pp1)的碱基序列为例如80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0176] 上述(Pp4)中,“杂交的多核苷酸”为上述(Pp4)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pp4)中,“杂交的多核苷酸”例如为与上述(Pp1)的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(Pp4)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0177] 上述(Pp5)的多核苷酸例如为上述(Pp5)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的碱基序列即可。上述(Pp5)的多核苷酸的碱基序列例如可以通过基于上述序列号12的氨基酸序列置换为对应的密码子而设计。
[0178] 牙鲆的NT5E蛋白的氨基酸序列(序列号12)
[0179] SGPHLRFEDEVDALQPHVDKLRTLGVDKIIALGHSGFTKDQEIAKKVRGVDVVIGGHTNTFLYTGTPPSSEVPAGPYPFLVKSDDGRQVPVVQAYAFGKYLGYLKVTFDDAGNVERATGNPILLNSSFPQDPDVLADVEKWKKNLANYSAQVVGQTLVFLNGESEECRFRECNLGNLICDAMVDNNIRIPDDVQWNHVSASIFNGGGVRASIDEQSRNGSITMEDLISVLPFGGTFDLVQLRGSTLRKAFEHSVRRYGQSTGEFLQVSGFHVEFDLSKPPGRRVTSLRILCTECRVPHYQPVEDETVYTVVLTSYMVKGGDGFDMIQNEIVKYNSGDLDISVVSRFIGKRKKVYPPVEGRIRIKNSASRLQGRAALLVSLSLLWSVCGTM
[0180] 上述(Pp6)中,关于氨基酸序列的“1或多个”例如为上述(Pp6)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pp6)的“1或多个”例如为上述序列号12的氨基酸序列中的例如1~78个、1~58个、1~39个、1~19个、1~15个、1~11个、1~7个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0181] 上述(Pp7)中,关于氨基酸序列的“同一性”例如为上述(Pp7)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pp7)的同一性相对于上述序列号12的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0182] (Pq)下述(Pq1)~(Pq7)中的任一多核苷酸:
[0183] (Pq1)由序列号25的碱基序列构成的多核苷酸;
[0184] (Pq2)由在上述(Pq1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0185] (Pq3)由相对于上述(Pq1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0186] (Pq4)由与由上述(Pq1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0187] (Pq5)编码由序列号26的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0188] (Pq6)编码由在序列号26的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0189] (Pq7)编码由相对于序列号26的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0190] 革胡子鲶的nt5e基因的碱基序列(序列号25)
[0191] 5'-ATGCGCTACTCGACAGCGGCGCGCGCGCTGCTCCCTTTGCTGGT AGTGTGCGCGAGCTTGCGGCTCGCGGCGGCAGACTGGGAGCTGACGCTCTTGCACACCAACGACGTGCACGCGCGGGTCGAGGAGACCAACAAGGACTCGGGCAAGTGCACGAAGGGAGAGTGCTTCGCCGGTGTCGCGCGGCGTTCCACGAAGATCAAAGAGATCCGGAGCAAGGAGAAGAACGTGCTGCTGCTGGACGCAGGGGATCAGTTTCAGGGCACCGTCTGGTTCAACGTCTACAAAGGCGATGAGGCGGCGCACTTCATGAACAAACTCCAATACGATGCCATGGCTTTGGGAAACCACGAGTTTGACAATAGAGTGGAAGGTCTCATACCCTTCCTGCAGAAGGTGAAGTGTCCTGTACTCAGCGCTAACATCAAGGCGGTTGAGCCTGTTGCGTCAAATATTAGCGGATATTTTTCACCTTATAAAATCTTAAATGTAACCTCTGAGAAAGTGGGTATAGTGGGATACACTACCAAGGAGACTCCAGCTCTGTCATTGCCAGGGCCGTACCTGCATTTTGAGGACGAGGTCGTAGCCGTGCAGCGGGAGGTAGACAAACTCATCGCTCTCGGCGTTAACAAGATCATCGCCCTCGGCCATTCTGGATTTGACACGGACAAAGAGATCGCCAAAAAGGTCCGTGGAGTGGACGTGGTGATTGGAGGACACACCAACACTTTTTTATACACAGGGGCTCCCCCATCCAGCGAGGTTCCAGCAGGACCCTACCCATTAATGGTACAGTCCGATGATGGTCGCAAAGTGCCAGTGGTCCAGGCGTACGCCTTTGGGAAATACCTTGGCTATCTCAAAGTGACTTTCGATTCTGCTGGAAACGTGATAAAAGCGGAAGGAAATCCAATCCTCCTAAATAGCAGCGTAACCGAAGATCCCAGCATTAAGGCAGATGTGGATACCTGGAAGGTCAAATTGGCCAATTACTCAGCTCAGTTTGTGGGAAACACTCTGGTCTACCTGAACGGGACATTTGAAGAGTGTCGATTTCGGGAATGCAACCTGGGAAACTTGATCTGCGATGCCATGGTCCATCACTACATCAAATATCCGGATGAACTCCAGTGGAACCATGTTAGTTCCTGTATTTTAAACGGAGGGGGCATACGATCCTCCATTGATGAGAGAAGCAGAAATGGTAGCATCACTATGGAGGACGTGTTGACCGTGCTGCCGTTTGGAGGAACATATGATCTGGTTCAACTGAATGGCTCGACTCTTCTCCAGGCCTTCGAGCACAGCGTCCACAGATATGGAGGAAACACTGGGGAGTTCCTACAGGTCTCAGGCTTTCAGCTGGAGTACGACCTCACCAAGCCCTCTGGTCATCGTGTGATCAAGGCGAGAGTGTTATGTACCGAGTGTCGAGTGCCACACTACGAGCCCCTGGACGCTACAAAAGTCTACAGGGTGGTGATGCCATCCTACCTAGTGGACGGAGGAGACGGTTTCTCAATGATCAAGCAGCAGATCCTGAAACATGATAGTGGTGACCTCGACATATCCGTCTTTTCTCGCTACATCACAGAGAGGCAGAGGGTTCACCCATCCGTGGAAGGACGAATCCGTCTCCTAAATTCTGCCGTGGAAATCTCAAACTCTTCCTCCTACACCCTCTGCGTCGTGATTCTCATTATTGTGGGTGTTATGCTCATTATGTTGGCTGGTGTCTACTACTACAGAAGGAAAGGTCTTGTTGATGATAAGGTTACAGTACAGTACAGAAGAGCTATAGATGGAGATGAAAAACTGAATGACCAAACCACAGTAACGAGTTCCTGA-3'
[0192] 上述(Pq1)中,序列号25的碱基序列为编码上述(Pq5)的氨基酸序列的碱基序列。上述序列号25的碱基序列例如可以由革胡子鲶(Clarias garienpinus)得到。
[0193] 上述(Pq2)中,“1或多个”例如为上述(Pq2)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pq2)的“1或多个”为上述(Pq1)的碱基序列中的例如1~370个、1~277个、1~185个、1~92个、1~74个、1~55个、1~37个、1~18个、1~9个、1~3个、1或2个、1个。
[0194] 上述(Pq3)中,“同一性”例如为上述(Pq3)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pq3)的同一性相对于上述(Pq1)的碱基序列为例如80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0195] 上述(Pq4)中,“杂交的多核苷酸”为上述(Pq4)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pq4)中,“杂交的多核苷酸”例如为与上述(Pq1)的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(Pq4)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0196] 上述(Pq5)的多核苷酸例如为上述(Pq5)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的碱基序列即可。上述(Pq5)的多核苷酸的碱基序列例如可以通过基于上述序列号26的氨基酸序列置换为对应的密码子而设计。
[0197] 革胡子鲶的NT5E蛋白的氨基酸序列(序列号26)
[0198] MRYSTAARALLPLLVVCASLRLAAADWELTLLHTNDVHARVEETNKDSGKCTKGECFAGVARRSTKIKEIRSKEKNVLLLDAGDQFQGTVWFNVYKGDEAAHFMNKLQYDAMALGNHEFDNRVEGLIPFLQKVKCPVLSANIKAVEPVASNISGYFSPYKILNVTSEKVGIVGYTTKETPALSLPGPYLHFEDEVVAVQREVDKLIALGVNKIIALGHSGFDTDKEIAKKVRGVDVVIGGHTNTFLYTGAPPSSEVPAGPYPLMVQSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKVTFDSAGNVIKAEGNPILLNSSVTEDPSIKADVDTWKVKLANYSAQFVGNTLVYLNGTFEECRFRECNLGNLICDAMVHHYIKYPDELQWNHVSSCILNGGGIRSSIDERSRNGSITMEDVLTVLPFGGTYDLVQLNGSTLLQAFEHSVHRYGGNTGEFLQVSGFQLEYDLTKPSGHRVIKARVLCTECRVPHYEPLDATKVYRVVMPSYLVDGGDGFSMIKQQILKHDSGDLDISVFSRYITERQRVHPSVEGRIRLLNSAVEISNSSSYTLCVVILIIVGVMLIMLAGVYYYRRKGLVDDKVTVQYRRAIDGDEKLNDQTTVTSS
[0199] 上述(Pq6)中,关于氨基酸序列的“1或多个”例如为上述(Pq6)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pq6)的“1或多个”例如为上述序列号26的氨基酸序列中的例如1~123个、1~92个、1~61个、1~30个、1~24个、1~18个、1~12个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0200] 上述(Pq7)中,关于氨基酸序列的“同一性”例如为上述(Pq7)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pq7)的同一性相对于上述序列号26的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0201] (Pl)下述(Pl1)~(Pl7)中的任一多核苷酸:
[0202] (Pl1)由序列号13的碱基序列构成的多核苷酸;
[0203] (Pl2)由在上述(Pl1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0204] (Pl3)由相对于上述(Pl1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0205] (Pl4)由与由上述(Pl1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0206] (Pl5)编码由序列号14的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0207] (Pl6)编码由在序列号14的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0208] (Pl7)编码由相对于序列号14的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0209] 鳉鱼的nt5e基因的碱基序列(序列号13)
[0210] 5'-ATGACTCTCCGCTGGCGCTGCTGCGCCCTCGGCGCCTTGCTCGG TCTCCTTCTCCGGTTAGACTCGTGGAGCGGAGCGTCCGGCTTCGAGCTGACTCTGCTCCACACCAACGACGTCCACGCTCGCATCGAGGAGACCAGCGAGGACTCGTCCAAATGCCACGAAGCGGGCTCGTGCTTCGCGGGGGTCGCCAGGATGTTCACCAAAGTGACGGAGATCCGGAGAAAGGAGACGCACGTGCTGTTTCTGGACGCTGGAGATCAATTTCAAGGCACGGTGTGGTTCAACTACTACAAAGGCAAAGAAGCTGCGCATTTCATGAACAAACTTGGTTATGACGTCATGACCTTTGGGAACCACGAGTTTGATAATGGAGTGGACAGTCTCACGCAAAACTTCCTCCAGCGCGTAAACTTCTCCGTAGTGTGTGCCACCATCAAACCGCTCCACAGTCTGGTTGCAAACATGAGCCGCTTCTACAGACCCTTTGCTGTTTTTAACGTGGGCTCAGAGAAGGTTGCTGTTGTTGGTTACACCACCAAAGAAACCCCTGTCTTATCTGCTCCAGGTCCTTATCTGAAGTTTGAGGATGAGGTGGAAGCCCTCCAGGATCAGGTCAACCAGCTAGAGAAGCTGGGTGTGAACAAGATCATCGCATTGGGACACTCTGGCTTTGAAGTGGACAAAGACATCGCCAAGCGTGTGAGAGGAATCGATGTAGTGATCGGAGGACACACAAACACCTTCCTGTACACAGGAAAGCCTCCTTCTACCGAAGTGCCGAGAGGACCCTATCCTTTCAATGTGAGCTCCAACGACGGGAGATGGGTGCCAGTGGTCCAAGCGTTCGCCTTCGGAAAATACCTGGGATACCTGAAGGTGACGTTCGACCAAGCTGGGAAGGTCGTAAAAGCCGTTGGAAACCCCATCCTGATGAACAGCAGCATCCCTCAAGATCCAGGGATCTTGTCGGATGTTGAAAAGTGGAAGAAGGGCTTGGAGCAGTATTCTTCCCAGTACATTGGACAAACTTTAGTCTACCTGAATGGAACGTTTGAAGAGTGTCGATTTAGGGAATGTAACCTGGGGAACCTCATCTGTGATGCCATGATATACAACTATATTAGGTATTCCAACAAGCTGCAGTGGAATCACGTGGGTGTTTGTATGCTGAACAGTGGATCCATACGAGCAACAATCGATGAACGCAGTACAAACGGCTCCATCACGATGGAGGAGATTCTCAGCGTCTTGCCGTTTGGAGGAACTTTTGACTTAGTGCAGCTGAAAGGATCTACGCTAAAAAAGGCTTTTGAGCACTCTGTTCACAGATATGGAGGGATGTCTGGAGAATTTCTTCAAGTGTCAGGTATCCGTGTGGAGTACGACCTCTCCAAACCCGTCAACCAGCGCGTTGTATCGCTGTTAATGCGTTGCACAGAATGCCGCGTTCCCAAGTTTGAACCGCTGGACCCTCAGAAGACGTACACCGTGGTCATGACCTCATTCATGGTGGGCGGAGGCGATGGCTATAGCATGATCCAAGATGAATTATTGAAGCATAACACAGGAAATTTGGACACTTTGGTTTTTTCCGAATACATCAAGGACATGAGGCGCGTGTACCCTGCAGTGGAAGGCCGCATCACCTTCAGGAACTCTGCAGCTTTTGCAGCTCACAGCCTGAGCCTGATGCTGCTGAGTCTGTGTCTTTTCCTGAACCTCTGCATGTGA-3'
[0211] 上述(Pl1)中,序列号13的碱基序列为编码上述(Pl5)的氨基酸序列的碱基序列。上述序列号13的碱基序列例如可以由鳉鱼(Oryziaslatipes)得到。
[0212] 上述(Pl2)中,“1或多个”例如为上述(Pl2)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pl2)的“1或多个”为上述(Pl1)的碱基序列中的例如1~351个、1~263个、1~175个、1~87个、1~70个、1~52个、1~35个、1~17个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0213] 上述(Pl3)中,“同一性”例如为上述(Pl3)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pl3)的同一性相对于上述(Pl1)的碱基序列为例如80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0214] 上述(Pl4)中,“杂交的多核苷酸”为上述(Pl4)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pl4)中,“杂交的多核苷酸”例如为与上述(Pl1)的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(Pl4)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0215] 上述(Pl5)的多核苷酸例如为上述(Pl5)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的碱基序列即可。上述(Pl5)的多核苷酸的碱基序列例如可以通过基于上述序列号14的氨基酸序列置换为对应的密码子而设计。
[0216] 鳉鱼的NT5E蛋白的氨基酸序列(序列号14)
[0217] MTLRWRCCALGALLGLLLRLDSWSGASGFELTLLHTNDVHARIEETSEDSSKCHEAGSCFAGVARMFTKVTEIRRKETHVLFLDAGDQFQGTVWFNYYKGKEAAHFMNKLGYDVMTFGNHEFDNGVDSLTQNFLQRVNFSVVCATIKPLHSLVANMSRFYRPFAVFNVGSEKVAVVGYTTKETPVLSAPGPYLKFEDEVEALQDQVNQLEKLGVNKIIALGHSGFEVDKDIAKRVRGIDVVIGGHTNTFLYTGKPPSTEVPRGPYPFNVSSNDGRWVPVVQAFAFGKYLGYLKVTFDQAGKVVKAVGNPILMNSSIPQDPGILSDVEKWKKGLEQYSSQYIGQTLVYLNGTFEECRFRECNLGNLICDAMIYNYIRYSNKLQWNHVGVCMLNSGSIRATIDERSTNGSITMEEILSVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGGMSGEFLQVSGIRVEYDLSKPVNQRVVSLLMRCTECRVPKFEPLDPQKTYTVVMTSFMVGGGDGYSMIQDELLKHNTGNLDTLVFSEYIKDMRRVYPAVEGRITFRNSAAFAAHSLSLMLLSLCLFLNLCM
[0218] 上述(Pl6)中,关于氨基酸序列的“1或多个”例如为上述(Pl6)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pl6)的“1或多个”例如为上述序列号14的氨基酸序列中的例如1~115个、1~86个、1~57个、1~28个、1~23个、1~17个、1~11个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0219] 上述(Pl7)中,关于氨基酸序列的“同一性”例如为上述(Pl7)的多核苷酸所编码的蛋白质具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Pl7)的同一性相对于上述序列号14的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0220] 本发明中,“肌苷酸分解活性”例如可以基于对象鱼类(被检鱼类)的生物试样中的肌苷酸量来评价,也可以基于被检鱼类的生物试样中的nt5e基因或NT5E蛋白的表达来评价。上述被检鱼类的生物试样没有特别限制,例如,可以为上述被检鱼类的鱼类个体和上述鱼类个体的部分中的任一者,优选为鱼类的骨骼肌。使用的生物试样的种类例如可以为一种,也可以为两种以上。
[0221] 基于上述被检鱼类的生物试样中的肌苷酸量来评价时,可以以具有野生型nt5e基因的鱼类或具有nt5e基因功能丧失体的鱼类死亡后第1天(24小时)内的鱼肉肌苷酸含量为基准,来评价肌苷酸分解活性。具体而言,基于后述的实施例1,测定被检鱼类死亡后24小时的生物试样中的肌苷酸量。然后,在上述被检鱼类的生物试样中的肌苷酸量与具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类的生物试样中的肌苷酸量相同时(无显著性差异)、(显著)低于具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类的生物试样中的肌苷酸量时和/或(显著)低于具有纯合型或杂合型的上述nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的肌苷酸量时,可以将上述被检鱼类评价为例如具有肌苷酸分解活性。另一方面,上述被检鱼类的生物试样中的肌苷酸量(显著)高于具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类的生物试样中的肌苷酸量时、与具有纯合型或杂合型的上述nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的肌苷酸量相同时(无显著性差异)和/或(显著)高于具有纯合型或杂合型的上述nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的肌苷酸量时,可以将上述被检鱼类评价为例如不具有肌苷酸分解活性。
[0222] 基于上述nt5e基因的表达来评价时,例如可以通过检测上述nt5e基因的表达、例如上述nt5e基因的mRNA的表达来实施。从上述鱼类的生物试样中提取mRNA可以通过常规方法来实施。上述nt5e基因的mRNA的表达的检测例如可列举半定量PCR、定量PCR、RNA印迹、数字式PCR、RNA测序分析(RNAseq)等检测。上述mRNA的表达的检测中使用的引物和/或探针例如可以通过本技术领域中的常规方法来设计。并且,上述被检鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量与具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类中的nt5e基因的表达量相同(无显著性差异)时、被检鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量(显著)高于具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类中的nt5e基因的表达量时和/或(显著)高于具有纯合型或杂合型的上述nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量时,可以将上述被检鱼类评价为例如具有肌苷酸分解活性。另一方面,上述被检鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量(显著)低于具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量时、与具有纯合型或杂合型的nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量相同(无显著性差异)时和/或(显著)低于具有纯合型或杂合型的上述nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量时,可以将上述被检鱼类评价为例如不具有肌苷酸分解活性。
[0223] 基于上述NT5E蛋白的表达来评价时,可以通过例如紫外吸收法、二辛可宁酸法等使用分光光度计的方法、ELISA、蛋白质印迹等来检测NT5E蛋白的表达。从上述鱼类制备包含蛋白质的提取液可以通过声波破碎、使用均化器的物理破碎等本技术领域中的常规方法来实施。并且,上述被检鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量与具有纯合型的上述野生型的NT5E蛋白的鱼类中的NT5E蛋白的表达量相同(无显著性差异)时、被检鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量(显著)高于具有纯合型的上述野生型的NT5E蛋白的鱼类中的NT5E蛋白的表达量和/或(显著)高于具有纯合型或杂合型的上述NT5E蛋白功能丧失体的鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量时,可以将上述被检鱼类评价为例如具有肌苷酸分解活性。另一方面,上述被检鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量(显著)低于具有纯合型的上述野生型的NT5E蛋白的鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量时、与具有纯合型或杂合型的NT5E蛋白功能丧失体的鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量相同(无显著性差异)时和/或(显著)低于具有纯合型或杂合型的上述NT5E蛋白功能丧失体的鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量时,可以将上述被检鱼类评价为例如不具有肌苷酸分解活性。
[0224] 本发明中,nt5e基因可以以RNA(例如mRNA)的形态或DNA的形态(例如cDNA或基因组DNA)存在。DNA可以为双链,也可以为单链。本发明中,上述基因可以包含非翻译区域(UTR)的序列等附加序列。
[0225] 上述nt5e基因功能丧失是指:具有上述nt5e基因功能丧失体的鱼类与具有野生型nt5e基因的鱼类(以下也称为“野生型鱼类”)相比,在鱼类的熟化中鱼肉中的肌苷酸量增加程度方面,上述nt5e基因的功能(显著)下降或丧失的状态。上述nt5e基因功能丧失具体而言例如可以是指上述nt5e基因的mRNA或该基因所编码的蛋白质的表达量(显著)下降的状态、或上述nt5e基因的mRNA或该基因所编码的蛋白质完全不表达的状态,也可以是指有功能的nt5e基因的mRNA或上述nt5e基因所编码的蛋白质的表达量下降的状态或有功能的nt5e基因的mRNA或上述nt5e基因所编码的蛋白质完全不表达的状态。因此,本发明中,上述nt5e基因功能丧失可以通过向上述nt5e基因中导入功能丧失性突变来实施,也可以通过导入抑制上述nt5e基因的表达的多核苷酸来实施。上述“抑制……基因的表达”可以是抑制基因的转录,也可以是抑制向蛋白质的翻译。
[0226] 本发明中,上述nt5e基因丧失功能的鱼类例如可以称为具有上述nt5e基因功能丧失体的鱼类。上述nt5e基因丧失功能的鱼类例如可以具有杂合型的上述nt5e基因功能丧失体,也可以具有纯合型的上述nt5e基因功能丧失体。上述nt5e基因丧失功能的鱼类中,上述nt5e基因以外的基因也可以进行了修饰、改变、导入和/或功能丧失。
[0227] 上述nt5e基因功能丧失例如可以通过对nt5e基因导入突变、更具体而言导入功能丧失性突变而引发。上述突变的种类没有特别限制,可列举例如点突变、错义突变、无义突变、移码突变、大范围碱基缺失(large deletion)等。上述突变例如可以使nt5e基因的一部分或全部发生缺失。上述移码突变引起碱基的缺失或插入,是三联读码框(密码子)错位时引起的突变。上述移码突变与碱基对置换突变相比,对基因功能造成的影响非常大。这是因为,发生上述移码突变时,该基因中的导入了上述移码突变的位置起的遗传密码大幅错位,不仅氨基酸发生变化,终止密码子等也会错位。
[0228] 上述nt5e基因功能丧失体例如为相对于野生型nt5e基因的碱基序列导入了1或多个碱基(以下也称为“1个碱基以上”)的插入、缺失和/或置换等突变的基因。上述1个碱基以上例如可以沿用上述(Pn2)、(Pt2)、(Po2)、(Pm2)、(Pg2)、(Pp2)、(Pq2)和(Pl2)的说明中的碱基数说明。上述移码突变例如可由于3m+1碱基或3m+2碱基(m为0以上的整数)的插入或缺失而发生。
[0229] 本发明中,上述nt5e基因中的突变例如可以通过对对象鱼类的基因组中的对象基因通过常规方法导入突变而引发。上述突变的导入方法例如可以通过下述等来实施:同源重组;使用ZFN、TALEN、CRISPR-CAS9、CRISPR-CPF1等的基因组编辑技术:等。上述突变的导入方法例如可以通过定点诱变法等突变导入法来实施。另外,上述突变的导入方法例如可以通过随机诱变法来实施。上述随机诱变法可列举例如α射线、β射线、γ射线、X射线等放射线照射处理;利用甲磺酸乙酯(EMS)、乙炔基亚硝基脲(ENU)等诱变剂的化学物质处理;重离子束处理;等。使用上述基因组编辑技术的突变导入方法例如可以参照后述的实施例1。具体而言,使用上述基因组编辑技术的突变导入例如可以通过导入构成基因组编辑技术的蛋白质和核酸、或编码这些的载体来实施。上述蛋白质可列举例如CRISPR(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats,规律成簇的间隔短回文重复)酶,作为具体例,可列举Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4等。上述核酸可列举例如crRNA和tracrRNA、或将这些借助接头连接而成的单链核酸。此时,上述核酸例如可设计成:使crRNA中的与标靶序列退火的碱基序列与编码nt5e基因的碱基序列互补的碱基序列。上述核酸可以单独使用一种,也可以将两种以上组合使用。使用上述基因组编辑技术时,例如可以通过将核酸设为两种以上而诱发标靶序列间的碱基序列的大范围碱基缺失。上述突变的导入方法例如可以通过定点诱变法等突变导入法来实施。
[0230] 上述nt5e基因功能丧失体中的突变位置、即对上述nt5e基因导入突变的位置没有特别限制,可以适当为与上述nt5e基因有关的任意区域。作为具体例,上述nt5e基因功能丧失体中的突变位置可列举例如上述nt5e基因的启动子区域等表达控制区域、包括编码上述nt5e基因所编码的蛋白质的编码区域在内的外显子区域、不编码上述nt5e基因所编码的蛋白质的非编码区域(例如内含子区域、增强子区域等)等,优选为外显子区域。上述外显子区域例如为第1外显子。
[0231] 作为具体例,上述鱼类为真鲷的情况下,上述nt5e基因中的突变位置可列举例如序列号1的碱基序列中第1~1200位、优选第1000~1100位、第1014~1036位的碱基。上述nt5e基因中的突变位置例如为与真鲷nt5e基因的第6外显子对应的位置。上述鱼类为红鳍东方鲀的情况下,上述nt5e基因中的突变位置可列举序列号3的碱基序列中第1~250位、优选第100~200位或第131~153位的碱基。上述nt5e基因中的突变位置例如为与红鳍东方鲀nt5e基因的第1外显子对应的位置。上述鱼类为罗非鱼的情况下,上述nt5e基因中的突变位置可列举序列号5的碱基序列中第1~300位、优选第200~250位、第217~239位的碱基。上述nt5e基因中的突变位置例如为与罗非鱼nt5e基因的第1外显子对应的位置。上述鱼类为牙鲆的情况下,上述nt5e基因中的突变位置可列举序列号5的碱基序列中第1~700位、优选第600~650位、第605~627位的碱基。上述nt5e基因中的突变位置例如为与牙鲆nt5e基因的第4外显子对应的位置。导入这些突变位置的突变优选为无义突变或移码突变。
[0232] 上述鱼类为真鲷、红鳍东方鲀、罗非鱼、麦奇钩吻鳟、暗色颌须鮈、牙鲆、革胡子鲶或鳉鱼的情况下,作为上述鱼类的nt5e基因功能丧失体,可以分别例示下述(MN)、(MT)、(MO)、(MM)、(MG)、(MP)、(MQ)和(ML)的多核苷酸、或编码这些的基因组区域。
[0233] (MN)下述(MN1)~(MN5)中的任一多核苷酸:
[0234] (MN1)由在序列号1的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成的多核苷酸;
[0235] (MN2)由相对于序列号1的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成的多核苷酸;
[0236] (MN3)由与由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成的多核苷酸;
[0237] (MN4)编码由在序列号2的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0238] (MN5)编码由相对于序列号2的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
[0239] 上述(MN1)~(MN5)的多核苷酸优选编码不具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0240] 上述(MN1)~(MN5)的多核苷酸中,“不具有肌苷酸分解活性”例如是指:与上述(Pn1)或(Pn5)的多核苷酸所编码的蛋白质相比,肌苷酸分解活性受到显著抑制,优选是指肌苷酸分解活性完全丧失。
[0241] 上述(MN1)的“1或多个”为上述序列号1的碱基序列中的例如1~351个、1~263个、1~175个、1~87个、1~70个、1~52个、1~35个、1~17个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0242] 上述(MN2)的同一性相对于上述序列号1的碱基序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0243] 上述(MN3)中,“杂交的多核苷酸”例如为与由上述序列号1的碱基序列构成的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述杂交例如可以通过各种杂交试验来检测。上述(MN3)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0244] 上述(MN4)的“1或多个”例如为上述序列号2的氨基酸序列中的例如1~116个、1~86个、1~58个、1~29个、1~23个、1~17个、1~11个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0245] 上述(MN5)的同一性相对于上述序列号2的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0246] (MT)下述(MT1)~(MT5)中的任一多核苷酸:
[0247] (MT1)由在序列号3的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成的多核苷酸;
[0248] (MT2)由相对于序列号3的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成的多核苷酸;
[0249] (MT3)由与由序列号3的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成的多核苷酸;
[0250] (MT4)编码由在序列号4的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0251] (MT5)编码由相对于序列号4的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
[0252] 上述(MT1)~(MT5)的多核苷酸优选为编码不具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0253] 上述(MT1)~(MT5)的多核苷酸中,“不具有肌苷酸分解活性”例如是指:与上述(Pt1)或(Pt5)的多核苷酸所编码的蛋白质相比,肌苷酸分解活性受到显著抑制,优选是指肌苷酸分解活性完全丧失。
[0254] 上述(MT1)的“1或多个”为上述序列号3的碱基序列中的例如1~348个、1~261个、1~174个、1~87个、1~69个、1~52个、1~34个、1~17个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0255] 上述(MT2)的同一性相对于上述序列号3的碱基序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0256] 上述(MT3)中,“杂交的多核苷酸”例如为与由上述序列号3的碱基序列构成的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(MT3)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0257] 上述(MT4)的“1或多个”例如为上述序列号4的氨基酸序列中的例如1~115个、1~86个、1~57个、1~28个、1~23个、1~17个、1~11个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0258] 上述(MT5)的同一性相对于上述序列号4的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0259] (MO)下述(MO1)~(MO5)中的任一多核苷酸:
[0260] (MO1)由在序列号5的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成的多核苷酸;
[0261] (MO2)由相对于序列号5的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成的多核苷酸;
[0262] (MO3)由与由序列号5的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成的多核苷酸;
[0263] (MO4)编码由在序列号6的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0264] (MO5)编码由相对于序列号6的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
[0265] 上述(MO1)~(MO5)的多核苷酸优选为编码不具有肌苷酸分解活性蛋白质的多核苷酸。
[0266] 上述(MO1)~(MO5)的多核苷酸中,“不具有肌苷酸分解活性”例如是指:与上述(Po1)或(Po5)的多核苷酸所编码的蛋白质相比,肌苷酸分解活性受到显著抑制,优选是指肌苷酸分解活性完全丧失。
[0267] 上述(MO1)的“1或多个”为上述序列号5的碱基序列中的例如1~351个、1~263个、1~175个、1~87个、1~70个、1~52个、1~35个、1~17个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0268] 上述(MO2)的同一性相对于上述序列号5的碱基序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0269] 上述(MO3)中,“杂交的多核苷酸”例如为与由上述序列号5的碱基序列构成的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(MO3)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0270] 上述(MO4)的“1或多个”例如为上述序列号6的氨基酸序列中的例如1~116个、1~87个、1~58个、1~29个、1~23个、1~17个、1~11个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0271] 上述(MO5)的同一性相对于上述序列号6的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0272] (MM)下述(MM1)~(MM5)中的任一多核苷酸:
[0273] (MM1)由在序列号7的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成的多核苷酸;
[0274] (MM2)由相对于序列号7的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成的多核苷酸;
[0275] (MM3)由与由序列号7的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成的多核苷酸;
[0276] (MM4)编码由在序列号8的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0277] (MM5)编码由相对于序列号8的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
[0278] 上述(MM1)~(MM5)的多核苷酸优选为编码不具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0279] 上述(MM1)~(MM5)的多核苷酸中,“不具有肌苷酸分解活性”例如是指:与上述(Pm1)或(Pm5)的多核苷酸所编码的蛋白质相比,肌苷酸分解活性受到显著抑制,优选是指肌苷酸分解活性完全丧失。
[0280] 上述(MM1)的“1或多个”为上述序列号7的碱基序列中的例如1~327个、1~245个、1~163个、1~81个、1~65个、1~49个、1~32个、1~16个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0281] 上述(MM2)的同一性相对于上述序列号7的碱基序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0282] 上述(MM3)中,“杂交的多核苷酸”例如为与由上述序列号7的碱基序列构成的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述杂交例如可以通过各种杂交试验来检测。上述(MM3)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0283] 上述(MM4)的“1或多个”例如为上述序列号8的氨基酸序列中的例如1~108个、1~81个、1~54个、1~27个、1~21个、1~16个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0284] 上述(MM5)的同一性相对于上述序列号8的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0285] (MG)下述(MG1)~(MG5)中的任一多核苷酸:
[0286] (MG1)由在序列号9的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成的多核苷酸;
[0287] (MG2)由相对于序列号9的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成的多核苷酸;
[0288] (MG3)由与由序列号9的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成的多核苷酸;
[0289] (MG4)编码由在序列号10的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0290] (MG5)编码由相对于序列号10的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
[0291] 上述(MG1)~(MG5)的多核苷酸优选为编码不具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0292] 上述(MG1)~(MG5)的多核苷酸中,“不具有肌苷酸分解活性”例如是指:与上述(Pg1)或(Pg5)的多核苷酸所编码的蛋白质相比,肌苷酸分解活性受到显著抑制,优选是指肌苷酸分解活性完全丧失。
[0293] 上述(MG1)的“1或多个”为上述序列号9的碱基序列中的例如1~327个、1~245个、1~163个、1~81个、1~65个、1~49个、1~32个、1~16个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0294] 上述(MG2)的同一性相对于上述序列号9的碱基序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0295] 上述(MG3)中,“杂交的多核苷酸”例如为与由上述序列号9的碱基序列构成的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述杂交例如可以通过各种杂交试验来检测。上述(MG3)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0296] 上述(MG4)的“1或多个”例如为上述序列号10的氨基酸序列中的例如1~108个、1~81个、1~54个、1~27个、1~21个、1~16个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0297] 上述(MG5)的同一性相对于上述序列号10的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0298] (MP)下述(MP1)~(MP5)中的任一多核苷酸:
[0299] (MP1)由在序列号11的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成的多核苷酸;
[0300] (MP2)由相对于序列号11的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成的多核苷酸;
[0301] (MP3)由与由序列号11的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成的多核苷酸;
[0302] (MP4)编码由在序列号12的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0303] (MP5)编码由相对于序列号12的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
[0304] 上述(MP1)~(MP5)的多核苷酸优选为编码不具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0305] 上述(MP1)~(MP5)的多核苷酸中,“不具有肌苷酸分解活性”例如是指:与上述(Pg1)或(Pg5)的多核苷酸所编码的蛋白质相比,肌苷酸分解活性受到显著抑制,优选是指肌苷酸分解活性完全丧失。
[0306] 上述(MP1)的“1或多个”为上述序列号11的碱基序列中的例如1~327个、1~245个、1~163个、1~81个、1~65个、1~49个、1~32个、1~16个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0307] 上述(MP2)的同一性相对于上述序列号11的碱基序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0308] 上述(MP3)中,“杂交的多核苷酸”例如为与由上述序列号11的碱基序列构成的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述杂交例如可以通过各种杂交试验来检测。上述(MP3)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0309] 上述(MP4)的“1或多个”例如为上述序列号12的氨基酸序列中的例如1~108个、1~81个、1~54个、1~27个、1~21个、1~16个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0310] 上述(MP5)的同一性相对于上述序列号12的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0311] (MQ)下述(MQ1)~(MQ5)中的任一多核苷酸:
[0312] (MQ1)由在序列号25的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成的多核苷酸;
[0313] (MQ2)由相对于序列号25的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成的多核苷酸;
[0314] (MQ3)由与由序列号25的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成的多核苷酸;
[0315] (MQ4)编码由在序列号25的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0316] (MQ5)编码由相对于序列号26的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
[0317] 上述(MQ1)~(MQ5)的多核苷酸优选为编码不具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0318] 上述(MQ1)~(MQ5)的多核苷酸中,“不具有肌苷酸分解活性”例如是指:与上述(Pq1)或(Pq5)的多核苷酸所编码的蛋白质相比,肌苷酸分解活性受到显著抑制,优选是指肌苷酸分解活性完全丧失。
[0319] 上述(MQ1)的“1或多个”为上述序列号25的碱基序列中的例如1~370个、1~277个、1~185个、1~92个、1~74个、1~55个、1~37个、1~18个、1~9个、1~3个、1或2个、1个。
[0320] 上述(MQ2)的同一性相对于上述序列号25的碱基序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0321] 上述(MQ3)中,“杂交的多核苷酸”例如为与由上述序列号25的碱基序列构成的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(MQ3)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0322] 上述(MQ4)的“1或多个”例如为上述序列号26的氨基酸序列中的例如1~123个、1~92个、1~61个、1~30个、1~24个、1~18个、1~12个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0323] 上述(MQ5)的同一性相对于上述序列号26的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0324] (ML)下述(ML1)~(ML5)中的任一多核苷酸:
[0325] (ML1)由在序列号13的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成的多核苷酸;
[0326] (ML2)由相对于序列号13的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成的多核苷酸;
[0327] (ML3)由与由序列号13的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成的多核苷酸;
[0328] (ML4)编码由在序列号14的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0329] (ML5)编码由相对于序列号14的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
[0330] 上述(ML1)~(ML5)的多核苷酸优选为编码不具有肌苷酸分解活性蛋白质的多核苷酸。
[0331] 上述(ML1)~(ML5)的多核苷酸中,“不具有肌苷酸分解活性”例如是指:与上述(Pl1)或(Pl5)的多核苷酸所编码的蛋白质相比,肌苷酸分解活性受到显著抑制,优选是指肌苷酸分解活性完全丧失。
[0332] 上述(ML1)的“1或多个”为上述序列号13的碱基序列中的例如1~351个、1~263个、1~175个、1~87个、1~70个、1~52个、1~35个、1~17个、1~8个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0333] 上述(ML2)的同一性相对于上述序列号13的碱基序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0334] 上述(ML3)中,“杂交的多核苷酸”例如为与由上述序列号13的碱基序列构成的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(ML3)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn)中的说明。
[0335] 上述(ML4)的“1或多个”例如为上述序列号14的氨基酸序列中的例如1~115个、1~86个、1~57个、1~28个、1~23个、1~17个、1~11个、1~8个、1~6个、1~5个、1~3个、1或2个、1个。
[0336] 上述(ML5)的同一性相对于上述序列号14的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0337] 作为其它例,上述鱼类为鳉鱼的情况下,作为上述鱼类的nt5e基因功能丧失体,可以例示下述(Ml)的多核苷酸或编码这些的基因组区域。
[0338] (Ml)下述(Ml1)~(Ml7)中的任一多核苷酸:
[0339] (Ml1)由序列号15的碱基序列构成的多核苷酸;
[0340] (Ml2)由在上述(Ml1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码不具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0341] (Ml3)由相对于上述(Ml1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码不具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0342] (Ml4)由与由上述(Ml1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码不具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0343] (Ml5)编码由序列号16的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0344] (Ml6)编码由在序列号16的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且不具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0345] (Ml7)编码由相对于序列号16的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且不具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0346] 上述(Ml1)~(Ml7)的多核苷酸中,“不具有肌苷酸分解活性”例如是指:与上述(Pl1)或(Pl5)的多核苷酸所编码的蛋白质相比,肌苷酸分解活性受到显著抑制,优选是指肌苷酸分解活性完全丧失。
[0347] 鳉鱼的nt5e基因功能丧失体的碱基序列(序列号15)
[0348] 5'-ATGACTCTCCGCTGGCGCTGCTGCGCCCTCGGCGCCTTGCTCGG TCTCCTTCTCCGGTTAGACTCGTGGAGCGGAGCGTCCGGCTTCGAGCTGACTCTGCTCCACACCAACGACGTCCACGCTCGCATCGAGGAGACCAGCGAGGACTCGTCCAAATGCCACGAAGCGGGCTCGTGCTTCGCGGGGGTCGCCAGGATGTTCACCAAAGACGGAGATCCGGAGAAAGGAGACGCACGTGCTGTTTCTGGACGCTGGAGATCAATTTCAAGGCACGGTGTGGTTCAACTACTACAAAGGCAAAGAAGCTGCGCATTTCATGAACAAACTTGGTTATGA-3'
[0349] 上述(Ml1)中,上述序列号15的碱基序列为序列号13的碱基序列的第208位和第209位的碱基缺失且第339~1734位的碱基缺失的碱基序列。上述序列号15的碱基序列为编码(Ml5)的氨基酸序列的碱基序列。
[0350] 上述(Ml2)中,“1或多个”例如为上述(Ml2)的多核苷酸所编码的蛋白质不具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Ml2)的“1或多个”为上述(Ml1)的碱基序列中的例如1~67个、1~50个、1~33个、1~16个、1~13个、1~10个、1~6个、1~3个、1或2个、1个。
[0351] 上述(Ml3)中,“同一性”例如为上述(Ml3)的多核苷酸所编码的蛋白质不具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Ml3)的同一性相对于上述(Ml1)的碱基序列为例如80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0352] 上述(Ml4)中,“杂交的多核苷酸”为上述(Ml4)的多核苷酸所编码的蛋白质不具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Ml4)中,“杂交的多核苷酸”例如为与上述(Ml1)的多核苷酸完全互补或部分互补的多核苷酸。上述(Ml4)中,上述杂交和严谨条件可以沿用上述(Pn4)中的说明。
[0353] 上述(Ml5)的多核苷酸例如为上述(Ml5)的多核苷酸所编码的蛋白质不具有肌苷酸分解活性碱基序列即可。上述(Ml5)的多核苷酸的碱基序列例如可以通过基于上述序列号16的氨基酸序列置换为对应的密码子而设计。
[0354] 鳉鱼的NT5E蛋白的突变体的氨基酸序列(序列号16)
[0355] MTLRWRCCALGALLGLLLRLDSWSGASGFELTLLHTNDVHARIEETSEDSSKCHEAGSCFAGVARMFTKDGDPEKGDARAVSGRWRSISRHGVVQLLQRQRSCAFHEQTWL
[0356] 上述(Ml6)中,关于氨基酸序列的“1或多个”例如为上述(Ml6)的多核苷酸所编码的蛋白质不具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Ml6)的“1或多个”例如为上述序列号16的氨基酸序列中的例如1~22个、1~16个、1~11个、1~5个、1~4个、1~3个、1或2个、1个。
[0357] 上述(Ml7)中,关于氨基酸序列的“同一性”例如为上述(Ml7)的多核苷酸所编码的蛋白质不具有肌苷酸分解活性的范围即可。上述(Ml7)的同一性相对于上述序列号16的氨基酸序列例如为80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上。
[0358] 本发明中,通过抑制上述nt5e基因的表达而使上述nt5e基因丧失功能时,上述nt5e基因的功能丧失例如可以通过将抑制上述nt5e基因的表达的多核苷酸导入对象鱼类来实施。上述多核苷酸的导入方法没有特别限制,例如可以通过RNA干扰、反义RNA、基因组编辑技术等方法来实施。包含上述多核苷酸的表达载体等表达盒例如可以通过显微注射、聚乙二醇法、电穿孔法(electroporation method)、粒子枪法等导入到对象鱼类中。上述对象鱼类可为例如卵、鱼苗、小鱼、未成鱼和成鱼中任一种。
[0359] 本发明的鱼类例如与具有野生型的(正常的)nt5e基因的鱼类相比能够抑制鲜度下降。上述鲜度可以使用K值来进行评价。上述K值可以基于对象鱼类的相对于骨骼肌重量(mg)的腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷一磷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、肌苷(HxR)和次黄嘌呤(Hx)的摩尔量(mol)的测定值使用下述式(1)来计算。上述相对于骨骼肌的ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx的摩尔量可以基于后述的实施例3记载的方法使用HPLC来定量。
[0360] (K值的计算式)
[0361] K=(HxR+Hx)/(ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx) ··· (1)
[0362] K:鲜度指标值
[0363] ATP:相对于肌肉重量的腺苷三磷酸的摩尔量
[0364] ADP:相对于肌肉重量的腺苷二磷酸的摩尔量
[0365] AMP:相对于肌肉重量的腺苷一磷酸的摩尔量
[0366] IMP:相对于肌肉重量的肌苷酸的摩尔量
[0367] HxR:相对于肌肉重量的肌苷的摩尔量
[0368] Hx:相对于肌肉重量的次黄嘌呤的摩尔量
[0369] 本发明的鱼类例如死亡后在4℃保存2天时,以死亡后在4℃保存2天的具有野生型的(正常的)nt5e基因的鱼类的K值为基准,具有K值降低5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上的鲜度维持活性或鲜度下降抑制活性。另外,本发明的鱼类例如死亡后在4℃保存2天时,以死亡后在4℃保存2天的具有野生型的(正常的)nt5e基因的鱼类的K值为基准,具有K值降低5~100%、5~95%、5~90%、10~85%、10~80%、10~75%、15~70%、15~65%、15~60%、20~55%、20~50%、20~45%、25~40%、25~35%、或25~30%的鲜度维持活性或鲜度下降抑制活性。因此,本发明的鱼类可以称为例如具有鲜度维持活性的鱼类或具有鲜度下降抑制活性的鱼类。
[0370] 本发明的鱼类如上所述可通过使野生型nt5e基因中产生功能丧失性突变而得到。因此,本发明的鱼类也可以称为例如“鱼类的突变体”。另外,本发明的鱼类可以为“鱼类的突变体”的后代品系,可以为上述nt5e基因中具有功能丧失性突变的鱼类。本发明的鱼类可以称为例如在上述nt5e基因的碱基序列中具有通过上述突变导入方法导入的遗传突变的鱼类突变体。本发明的鱼类不包括例如实质上仅通过基本生物学过程(an essentiallybiological process)的手段得到的鱼类。
[0371] 关于本发明的鱼类的制造方法,可以沿用后述的第1生产方法、第2生产方法、筛选方法和第3生产方法的说明。
[0372] <鱼类的部分>
[0373] 另一方式中,本发明提供可增加或加速熟化时的肌苷酸蓄积的鱼类的部分。本发明的鱼类的部分为上述本发明的鱼类的部分。
[0374] 本发明的鱼类可以为上述本发明的第1鱼类,也可以为后述的本发明的第2鱼类。
[0375] 上述鱼类的部分可列举例如鱼类的可食用部分。作为具体例,上述鱼类的部分可列举例如肌肉、生殖器(例如睾丸、卵巢)、皮、肝脏和骨等。
[0376] <第1生产方法>
[0377] 另一方式中,本发明提供使用本发明的鱼类的、本发明的鱼类的生产方法、本发明的鱼类的再生产方法。本发明的鱼类的生产方法包括下述(a)工序:
[0378] (a)使本发明的鱼类与其它鱼类进行杂交的工序。
[0379] 本发明的第1生产方法由于在上述(a)工序中使用上述本发明的鱼类,因此例如可以生产熟化加速的鱼类。
[0380] 上述(a)工序中,用作第一亲本的鱼类为上述本发明的鱼类即可。如上所述,上述本发明的鱼类例如可以通过后述的上述本发明的赋予方法、第2生产方法、筛选方法和第3生产方法得到。因此,上述本发明的第1生产方法例如可以在上述(a)工序之前实施上述本发明的赋予方法、第2生产方法、筛选方法和第3生产方法中的任意1种以上。此时,各方法的说明可以沿用后述的各方法的说明。
[0381] 作为具体例,本发明的第1生产方法可以包括下述(x)工序或(y)工序。
[0382] (x)从被检鱼类中选拔本发明的鱼类的工序(选拔工序)
[0383] (y)由对象鱼类制作本发明的鱼类的工序(制作工序)
[0384] 上述(x)工序中,上述鱼类的选拔可以称为上述nt5e基因丧失功能的鱼类的选拔。因此,上述(x)工序例如可以通过下述(x1)工序和(x2)工序来进行。
[0385] (x1)检测上述被检鱼类的nt5e基因是否丧失功能的检测工序
[0386] (x2)在上述nt5e基因丧失功能时,将上述被检鱼类选拔为本发明的鱼类的选拔工序
[0387] 上述(x)工序包括上述(x1)工序和(x2)工序时,上述(x)工序例如可以以上述nt5e基因的碱基序列为指标来实施,也可以以上述nt5e基因或上述NT5E蛋白的表达量为指标来实施。
[0388] 以上述nt5e基因的碱基序列为指标时,在上述(x1)工序中,上述nt5e基因丧失功能的检测例如可以通过解读上述被检鱼类的nt5e基因的碱基序列、并且与对应的野生型nt5e基因或nt5e基因功能丧失体的碱基序列进行比较来实施。上述碱基序列的解读例如可以使用测序仪来实施。然后,在上述(x2)工序中,例如上述被检鱼类的nt5e基因的碱基序列分别为对于对应鱼类的野生型nt5e基因的碱基序列导入了功能丧失性突变的碱基序列时,或者,与对应鱼类的nt5e基因功能丧失体的碱基序列一致时,选拔为上述本发明的鱼类。关于上述选拔的条件,如上所述。上述野生型nt5e基因的碱基序列可以参照上述的各鱼类的野生型nt5e基因的碱基序列。另外,上述nt5e基因功能丧失体的碱基序列可以参照上述的各鱼类的nt5e基因功能丧失体的碱基序列。上述碱基序列的比较例如可以通过碱基序列的分析软件(例如上述的BLAST等)来实施。在上述(x2)工序中,进行碱基序列比较的区域可以为nt5e基因的内含子区域,可以为nt5e基因的外显子区域,优选为后者。另外,上述nt5e基因的丧失功能分别由对于对应野生型nt5e基因的碱基序列导入1个碱基以上的插入、缺失和/或置换等突变引起时,在上述(x1)工序中,例如可以使用能够检测至少1个突变的引物组、探针、或这些的组合来实施。上述引物组和探针例如可以基于上述突变的种类通过本技术领域中的常规方法来设计。
[0389] 在上述(x2)工序中,例如相对于上述野生型nt5e基因进行了1个碱基以上的插入、缺失和/或置换时,可以将上述基因判断为功能丧失基因。另外,在上述(x2)工序中,例如相对于上述野生型nt5e基因导入了移码突变时,可以将上述基因判断为功能丧失基因。进而,在上述(x2)工序中,例如上述野生型nt5e基因发生了部分缺失或完全缺失时,可以将上述基因判断为功能丧失基因。
[0390] 在上述(x2)工序中,例如具有杂合型或纯合型的上述nt5e基因功能丧失体时,可以将上述被检鱼类选拔为本发明的鱼类。
[0391] 以上述nt5e基因的表达量为指标时,在上述(x1)工序中,上述nt5e基因丧失功能的检测例如可以通过检测上述被检鱼类的nt5e基因的mRNA或nt5e基因所编码的蛋白质的功能来实施。进而,上述(x1)工序中,上述nt5e基因丧失功能的检测例如可以通过检测上述被检鱼类中的nt5e基因或nt5e基因所编码的蛋白质的表达的有无、或者nt5e基因或nt5e基因所编码的蛋白质的表达量来实施。
[0392] 在上述(x)工序中,基于上述nt5e基因所编码的蛋白质的表达进行判断时,在上述(x1)工序中测定例如上述被检鱼类的生物试样中的nt5e基因和nt5e基因所编码的蛋白质中的至少一者的表达量。然后,上述(x2)工序中基于上述被检鱼类的生物试样中的nt5e基因和nt5e基因所编码的蛋白质中的至少一者的表达量和基准值来选拔上述nt5e基因丧失功能的鱼类(丧失功能鱼类)。具体而言,在上述(x2)工序中,上述被检鱼类中的上述丧失功能鱼类的选拔例如可以通过对上述被检鱼类的生物试样中的nt5e基因和nt5e基因所编码的蛋白质中的至少一者的表达量和上述基准值进行比较来实施。
[0393] 上述被检鱼类的生物试样没有特别限制,可以为例如上述被检鱼类的鱼类个体和上述鱼类个体的部分中的任一者,优选为鱼类的骨骼肌。上述(x1)工序中使用的生物试样的种类例如可以为一种,也可以为两种以上。
[0394] 上述(x1)工序中,nt5e基因的表达量例如可以通过半定量PCR、定量PCR、RNA印迹、数字式PCR、RNA测序分析(RNAseq)等来测定。另外,上述(x1)工序中,nt5e基因所编码的蛋白质的表达量例如可以通过紫外吸收法、二辛可宁酸法等使用分光光度计的方法、ELISA、蛋白质印迹等蛋白质定量方法来测定。
[0395] 上述基准值可列举例如上述野生型鱼类中的nt5e基因或nt5e基因所编码的蛋白质的表达量、具有nt5e基因功能丧失体的鱼类中的nt5e基因或nt5e基因所编码的蛋白质的表达量等。使用上述丧失功能鱼类中的nt5e基因的表达量作为上述基准值时,上述丧失功能鱼类例如既可以是一对染色体各自上的2个nt5e基因中的任一基因丧失功能的鱼类、即杂合型的鱼类,也可以是两个基因丧失功能的鱼类、即纯合型的鱼类。作为上述基准值的nt5e基因或nt5e基因所编码的蛋白质的表达量例如可以如下得到:通过与上述被检鱼类的生物试样同样的方法,来测定以与上述被检鱼类的生物试样相同的条件采集的生物试样中的nt5e基因或nt5e基因所编码的蛋白质的表达量,从而得到。上述基准值例如可以预先测定,也可以与上述被检鱼类的生物试样同时测定。
[0396] 此时,在上述(x2)工序中,上述被检鱼类中的nt5e基因是否丧失功能的评价方法没有特别限制,可以根据上述基准值的种类而适当确定。
[0397] 作为具体例,上述被检鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量与具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类中的nt5e基因的表达量相同(无显著性差异)时、被检鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量(显著)高于具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类中的nt5e基因的表达量时和/或(显著)高于具有纯合型或杂合型的上述nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量时,可以将上述被检鱼类评价为例如上述nt5e基因丧失功能。另一方面,上述被检鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量(显著)低于具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量时、与具有纯合型或杂合型的nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量相同(无显著性差异)时和/或(显著)低于具有纯合型或杂合型的上述nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的nt5e基因的表达量时,可以将上述被检鱼类评价为例如上述nt5e基因丧失功能。
[0398] 另外,上述被检鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量与具有纯合型的上述野生型的NT5E蛋白的鱼类中的NT5E蛋白的表达量相同(无显著性差异)时、被检鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量(显著)高于具有纯合型的上述野生型的NT5E蛋白的鱼类中的NT5E蛋白的表达量和/或(显著)高于具有纯合型或杂合型的上述NT5E蛋白功能丧失体的鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量时,可以将上述被检鱼类评价为例如上述nt5e基因丧失功能。另一方面,上述被检鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量(显著)低于具有纯合型的上述野生型的NT5E蛋白的鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量时、与具有纯合型或杂合型的NT5E蛋白功能丧失体的鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量相同(无显著性差异)时和/或(显著)低于具有纯合型或杂合型的上述NT5E蛋白功能丧失体的鱼类的生物试样中的NT5E蛋白的表达量时,可以将上述被检鱼类评价为例如上述nt5e基因丧失功能。
[0399] 然后,在上述(x2)工序中,例如将上述评价为nt5e基因丧失功能的鱼类选拔为上述本发明的鱼类。
[0400] 上述(x2)工序中,例如可以基于nt5e基因的表达量来评价nt5e基因的基因型,作为具体例,可以评价为正常基因的纯合型、正常基因与功能丧失基因的杂合型、功能丧失基因的纯合型。此时,作为上述基准值,可以分别使用具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类(野生型鱼类)、具有杂合型或纯合型的上述nt5e基因功能丧失体的鱼类(杂合型的鱼类或纯合型的鱼类)来实施。具体而言,在上述(x2)工序中,被检鱼类中的对象基因的表达量与上述野生型鱼类、上述杂合型的鱼类或上述纯合型鱼类中的对象基因的表达量同等时,上述被检鱼类例如可以评价为与具有同等表达量的鱼类同样的基因型。
[0401] 上述(y)工序例如也可以称为使对象鱼类的nt5e基因丧失功能的工序(功能丧失工序)。上述功能丧失工序可以沿用后述的本发明的赋予方法中的功能丧失工序的说明。
[0402] 接着,在上述(a)工序中,作为另一亲本使用的鱼类没有特别限制,可以为具有任意的性状的鱼类。用作上述另一亲本的鱼类也可以为上述本发明的鱼类。
[0403] 上述(a)工序中,上述本发明的鱼类与上述其它鱼类的杂交方法没有特别限制,可以采用公知的方法。上述(a)工序中,通过上述本发明的鱼类与上述其它鱼类的杂交可以得到后代品系的鱼类。
[0404] 本发明的第1生产方法可以还包括下述(b)工序。
[0405] (b)从通过上述(a)工序得到的鱼类或其后代品系中选拔胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的鱼类的选拔工序。
[0406] 上述(b)工序中,要选拔nt5e基因丧失功能鱼类的对象例如可以为通过上述(a)工序得到的鱼类,还可以为由该鱼类得到的后代品系。具体而言,上述对象例如可以为通过上述(a)工序的杂交而得到的F1代鱼类,也可以为其后代品系。上述后代品系例如可以为通过上述(a)工序的杂交而得到的F1代鱼类的自交后代或回交后代,也可以为通过使上述F1代鱼类等后代品系的鱼类与其它鱼类杂交而得到的鱼类。
[0407] 上述(b)工序中,上述nt5e基因丧失功能的鱼类的选拔例如可以通过直接或间接确认上述nt5e基因丧失功能来进行。
[0408] 上述(b)工序中,上述直接确认可以对得到的上述F1代鱼类或其后代品系基于例如生物试样中的肌苷酸量来判断。具体而言,上述nt5e基因丧失功能这一点可以以具有野生型nt5e基因的鱼类、或具有nt5e基因功能丧失体的鱼类死亡后第1天(24小时)内的鱼肉中的肌苷酸的含量为基准来进行评价。更具体而言,基于后述的实施例1测定被检鱼类死亡后24小时内的生物试样中的肌苷酸量。然后,上述被检鱼类的生物试样中的肌苷酸量与具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类的生物试样中的肌苷酸量相同时(无显著性差异)、(显著)低于具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类的生物试样中的肌苷酸量和/或(显著)低于具有纯合型或杂合型的上述nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的肌苷酸量时,可以将上述被检鱼类评价为例如上述nt5e基因未丧失功能。另一方面,上述被检鱼类的生物试样中的肌苷酸量(显著)高于具有纯合型的上述野生型nt5e基因的鱼类的生物试样中的肌苷酸量、与具有纯合型或杂合型的上述nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的肌苷酸量相同时(无显著性差异)和/或(显著)高于具有纯合型或杂合型的上述nt5e基因功能丧失体的鱼类的生物试样中的肌苷酸量时,可以将上述被检鱼类评价为例如上述nt5e基因丧失功能。
[0409] 另外,上述(b)工序中,基于上述间接确认的选拔例如可以通过下述(b1)和(b2)工序来进行。
[0410] (b1)由上述(a)工序来检测被检鱼类的nt5e基因是否丧失功能的检测工序
[0411] (b2)上述nt5e基因丧失功能时,将上述被检鱼类选拔为nt5e基因丧失功能的鱼类的选拔工序
[0412] 上述(b)工序中的nt5e基因丧失功能的鱼类的选拔例如与上述(x)工序中说明的方法同样,上述(b1)工序可以与上述(x1)工序同样实施,上述(b2)工序可以与上述(x2)工序同样实施。
[0413] 本发明的第1生产方法优选对上述(b)工序中选拔出的鱼类进一步进行饲养。上述鱼类的饲养条件和饲养方法例如可以根据上述鱼类的生长阶段和上述鱼类的品种来适当确定。上述饲养例如可以生长至上述鱼类的任意生长阶段。
[0414] 由此,上述(b)工序中可以选拔上述nt5e基因丧失功能的鱼类或其后代品系。
[0415] 本发明的第1生产方法可以还包括从通过杂交得到的上述后代品系中采集配子(例如卵、精子)的采集工序。
[0416] <第2生产方法>
[0417] 另一方式中,本发明提供熟化加速的鱼类的生产方法。本发明的生产方法为熟化加速的鱼类的生产方法,包括使对象鱼类的胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的功能丧失工序。根据本发明的第2生产方法,可以得到熟化加速的鱼类。另外,根据本发明的第2生产方法,例如可以加速熟化时的肌苷酸的蓄积。因此,本发明的第2生产方法例如也可以称为熟化时的肌苷酸的蓄积加速的鱼类的生产方法。
[0418] 另外,本发明的鱼类例如在熟化时抑制肌苷酸分解为肌苷和次黄嘌呤,因此保存相同时间时可维持鲜度。因此,本发明的增强方法例如也可以称为鲜度得到维持的鱼类的生产方法、鲜度的下降受到抑制的鱼类的生产方法、鱼类的鲜度维持方法、或鱼类的鲜度的下降抑制方法。
[0419] 本发明中,如上所述,上述nt5e基因丧失功能可以通过向上述nt5e基因导入功能丧失性突变来实施,也可以通过导入抑制上述nt5e基因的表达的多核苷酸来实施,还可以通过使对象鱼类与本发明的鱼类杂交、即杂交引入上述nt5e基因功能丧失体来实施。通过上述杂交而实施时,本发明的赋予方法例如可以与上述本发明的第1生产方法同样地实施。
[0420] 向上述nt5e基因导入功能丧失性突变时,上述功能丧失工序中,例如向对象鱼类的nt5e基因中导入功能丧失性突变。上述对象鱼类例如在一对染色体中分别具有上述nt5e基因。因此,上述功能丧失工序中,例如可以使上述对象鱼类中的一对染色体的上述nt5e基因中的、任一染色体的上述nt5e基因丧失功能,也可以使两条染色体的上述nt5e基因丧失功能,优选后者。
[0421] 上述nt5e基因丧失功能例如可以如上所述通过导入突变来实施。上述突变例如可以沿用上述说明,优选为无义突变或移码突变。上述功能丧失性突变例如可以通过对各基因(各基因的碱基序列)进行1或多个碱基的缺失、置换、插入和/或添加来导入,优选通过使野生型nt5e基因部分缺失或完全缺失来导入。
[0422] 上述功能丧失工序中,向上述nt5e基因中导入功能丧失性突变的区域可以为上述nt5e基因的内含子区域,也可以为外显子区域,优选为后者。
[0423] 上述nt5e基因丧失功能例如可以通过对对象鱼类的nt5e基因通过常规方法导入突变而引起。上述突变的导入方法例如可以通过下述来实施:同源重组;使用ZFN、TALEN、CRISPR-CAS9、CRISPR-CPF1等的基因组编辑技术:等。使用上述基因组编辑技术的突变导入方法例如可以参照后述的实施例1。另外,上述突变导入方法例如可以通过随机诱变法来实施。上述随机诱变法可列举例如:α射线、β射线、γ射线、X射线等放射线照射处理;利用甲磺酸乙酯(EMS)、乙炔基亚硝基脲(ENU)等诱变剂的化学物质处理;重离子束处理;等。需要说明的是,上述的各突变导入方法例如可以使用市售的试剂盒等来实施。
[0424] 上述对象鱼类可包括例如卵、鱼苗、小鱼、未成鱼和成鱼中的任一种。
[0425] 本发明的第2生产方法优选在上述功能丧失工序后选拔上述nt5e基因中导入有功能丧失性突变的鱼类。上述选拔对象鱼类例如可以为上述功能丧失工序中得到的鱼类,也可以为其后代品系。上述选拔例如可以与上述的(x)工序同样地实施,可以沿用其说明。
[0426] 接着,导入抑制上述nt5e基因的表达的多核苷酸时,上述多核苷酸的导入方法没有特别限制,例如,可以通过RNA干扰、反义RNA、基因组编辑技术等方法来实施。包含上述多核苷酸的表达载体等表达盒例如可以通过显微注射、聚乙二醇法、电穿孔法、粒子枪法等导入到对象鱼类中。上述对象鱼类可以例如卵、鱼苗、小鱼、未成鱼和成鱼中的任一种。
[0427] <肌苷酸含量的增加方法>
[0428] 另一方式中,本发明提供可增加鱼类或鱼肉熟化中的肌苷酸含量的方法。本发明的增加方法为鱼肉熟化中的肌苷酸含量的增加方法,包括使鱼类或鱼肉熟化的熟化工序,上述鱼肉为本发明的鱼类、本发明的鱼类的鱼肉和/或本发明的鱼类的可食用部分的鱼肉。根据本发明的增加方法,可以在熟化时增加上述鱼类或鱼肉中的肌苷酸含量。本发明的增加方法例如与具有纯合型的野生型nt5e基因的鱼类相比,熟化时的肌苷酸增加得到增强,因此可以更快达到相同的肌苷酸含量。因此,本发明的增加方法例如也可以称为鱼类或鱼肉的熟化加速方法、或者鱼类或鱼肉中的肌苷酸的蓄积加速方法。
[0429] 上述熟化工序中,上述鱼类或鱼肉的熟化方法例如可以应用上述鱼类或鱼肉的通常的熟化条件。作为具体例,上述熟化时的温度例如为1~10℃。上述熟化的时间(熟化期)例如为0.1~31天、0.5~20天、或1~3天。
[0430] <筛选方法>
[0431] 另一方式中,本发明提供熟化加速的鱼类的筛选方法。本发明的熟化加速的鱼类的筛选方法包括从被检鱼类中选拔胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的被检鱼类来作为熟化加速的鱼类的选拔工序。根据本发明,可以筛选熟化加速的鱼类。本发明的筛选方法例如也可以称为具有肌苷酸蓄积增加(加速)能力的鱼类的筛选方法。
[0432] 另外,本发明的鱼类例如在熟化时抑制肌苷酸分解为肌苷和次黄嘌呤,因此保存相同时间时可维持鲜度。因此,本发明的筛选方法例如也可以称为鲜度得到维持的鱼类的筛选方法、或鲜度下降受到抑制的鱼类的筛选方法。
[0433] 本发明的筛选方法中,上述选拔工序可以与上述(x)工序同样实施,可以沿用其说明。
[0434] <第3生产方法>
[0435] 另一方式中,本发明提供熟化加速的鱼类的生产方法。本发明的鱼类的生产方法包括从被检鱼类中筛选nt5e基因丧失功能的被检鱼类的筛选工序,上述筛选工序通过上述本发明的熟化加速的鱼类的筛选方法来实施。根据本发明的第3生产方法,可以筛选具有上述nt5e基因功能丧失体的鱼类,因此可以生产熟化加速的鱼类。
[0436] <第2鱼类>
[0437] 另一方式中,本发明提供熟化加速的鱼类。本发明的鱼类(以下也称为“第2鱼类”)通过上述本发明的第1生产方法、第2生产方法或第3生产方法得到。根据本发明的鱼类,可以提供熟化加速的鱼类。另外,根据本发明,可以在鱼类死亡后加速鱼肉中的肌苷酸蓄积,因此可期待得到既有嚼头又有鲜味的鱼类。
[0438] <检测方法>
[0439] 另一方式中,本发明提供能够检测鱼类的熟化加速能力的方法。本发明的检测方法包括检测被检鱼类中胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因是否丧失功能的检测工序。根据本发明的检测方法,可以检测被检鱼类在熟化时熟化是否加速或熟化时肌苷酸的蓄积是否增加。因此,本发明的检测方法例如也可以称为具有熟化加速能力的鱼类的筛选方法或具有肌苷酸的蓄积增加(加速)能力的鱼类的筛选方法。
[0440] 本发明的检测方法例如包括:对被检鱼类的nt5e基因,检测功能缺失突变的检测工序。上述检测工序例如可以沿用上述本发明的第1生产方法的选拔工序中的(x)工序或上述间接选拔的说明。作为具体例,在上述检测工序中,例如对于nt5e基因,检测基因表达或其碱基序列。
[0441] 本发明的检测方法优选还包括:基于上述基因表达或碱基序列来判定上述被检鱼类的nt5e基因是野生型nt5e基因还是nt5e基因功能丧失体的判定工序。上述判定工序例如可以通过将上述被检鱼类的nt5e基因分别与对应鱼类的野生型nt5e基因进行比较来进行判定。具体而言,上述判定工序中,上述被检鱼类的nt5e基因具有与对应鱼类的野生型nt5e基因相同的碱基序列或具有非功能丧失性突变的突变时、或者,与对应鱼类的nt5e基因功能丧失体的碱基序列一致时,可以判定为上述被检鱼类的nt5e基因为野生型nt5e基因。另一方面,上述判定工序中,上述被检鱼类的nt5e基因在对应鱼类的野生型nt5e基因中具有功能丧失性突变时、或者与对应鱼类的nt5e基因功能丧失体的碱基序列一致时,可以判定为上述被检鱼类的nt5e基因为上述nt5e基因功能丧失体。
[0442] <加工食品>
[0443] 另一方式中,本发明提供使用本发明的鱼类的加工食品。本发明的鱼类的加工食品使用本发明的鱼类。
[0444] 本发明的鱼类的加工食品可以使用上述本发明的第1鱼类作为加工对象鱼类,也可以使用上述本发明的第2鱼类作为加工对象鱼类。
[0445] 本发明的加工食品中,“加工”没有特别限制,例如是指对鱼类的任意处理。作为具体例,上述加工可列举例如切割、切片、剁碎、过筛、干燥、装罐、装瓶、清洗、包装、冷冻、加热、调味等。上述加工食品的制造中实施的加工可以是一种,也可以是多种。另外,上述加工食品的制造中可以将同一处理实施1次也可以实施多次。
[0446] 【实施例】
[0447] 以下,使用实施例详细地说明本发明,但是本发明不限于实施例记载的方式。
[0448] [实施例1]
[0449] 制作nt5e基因丧失功能的鳉鱼,分别与野生型的鳉鱼进行比较,确认肌苷酸的蓄积增加、即nt5e基因编码肌苷酸的分解酶。
[0450] (1)受精卵的制作
[0451] 将性成熟的鳉鱼放入同一水槽内,使用隔板等从显微注射前一天的傍晚起按照雌雄而隔离。在显微注射当天拆除隔板,使其自然交配,由此获得单细胞期的受精卵。回收的卵用镊子等除去卵膜上的附着丝,用于显微注射中。
[0452] (2)丧失功能的鳉鱼的制作
[0453] 突变导入参照下述参考文献1使用CRISPR-Cas9而实施。Cas9使用购自IntegratedDNA Technologies株式会社的蛋白质试剂。
[0454] 参考文献1:Satoshi Ansai et.al,“Targeted mutagenesis using CRISPR/Cassystemin medaka”,Biology Open,2014,vol.3,pages 362-371
[0455] 单向导RNA(sgRNA)通过不需要载体的非克隆方法而合成。合成用的模板DNA通过使用3种寡核苷酸(OligoA-gRNA1或OligoA-sgRNA2·OligoB·OligoC)的PCR来制备。模板DNA和试剂盒(CUGA(注册商标)7gRNA Synthesis Kit、Nippon Gene Co.,Ltd.制),合成sgRNA1和sgRNA2后,使用RNA纯化试剂盒(RNeasy Plus Mini Kit、Qiagen公司制)来纯化上述sgRNA1和sgRNA2。上述sgRNA的基因组上的靶位点为存在于胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因的外显子1或外显子9的下述靶序列。鳉鱼基因组数据库中存在10种nt5基因。据报道,这些中的被归入胞外型的nt5e基因通常对肌苷酸的亲和性高(参照参考文献2)。鳉鱼具有两种nt5e基因,根据同源分析结果,将在很多鱼类中保守的22号染色体上的nt5e基因(ENSORLG00000014932)作为靶标。下述靶序列中,3’端侧的下划线所示的3个碱基为原间隔子相邻基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列。
[0456] 参考文献2:H Zimmermann,“5'-Nucleotidase:molecular structure andfunctional aspects”,Biochem J.1992Jul 15;285(Pt 2)(Pt 2):345-65.
[0457] (OligoA-sgRNA1)
[0458] 5'-CTAATACGACTCACTATAGCAGGATGTTCACCAAAGTGAGTTTT AGAGCTAGAAATAGCA-3'(序列号17)
[0459] (OligoA-sgRNA2)
[0460] 5'-CTAATACGACTCACTATAGGTGATGCGGCCTTCCACTGCGTTTTA GAGCTAGAAATAGCA-3'(序列号18)
[0461] (OligoB)
[0462] 5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACT AGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'(序列号19)
[0463] (OligoC)
[0464] 5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3'(序列号20)
[0465] (外显子1上的靶序列:sgRNA1)
[0466] 5'-CAGGATGTTCACCAAAGTGACGG-3'(序列号21)
[0467] (外显子9上的靶序列:sgRNA2)
[0468] 5'-GTGATGCGGCCTTCCACTGCAGG-3'(序列号22)
[0469] 对于上述(1)中得到的单细胞期的受精卵的细胞质,通过显微注射法导入500ng/μL Cas9蛋白质和100ng/μL sgRNA1,由此向nt5e基因导入突变(例1)。另外,对于上述(1)中得到的单细胞期的受精卵的细胞质,通过显微注射法导入500ng/μL Cas9蛋白质、100ng/μLsgRNA1和100ng/μL sgRNA2,由此向nt5e基因导入突变(例子2)。然后,使导入了突变的上述鳉鱼与野生型鳉鱼交配,得到第2代鳉鱼。对从上述第2代鳉鱼的尾鳍提取的DNA进行分析,通过PCR和碱基序列分析来筛选nt5e基因中可见碱基缺损的个体。使上述个体进行交配,由此得到导入了nt5e基因的功能缺失突变的个体。上述导入了nt5e基因的功能缺失突变的个体中,例子1为2个碱基缺失体系(Δ2)。另外,上述导入了nt5e基因的功能缺失突变的个体中,例子2为5521个碱基缺失体系(Δ5521)。
[0470] 培养上述制作后的受精卵,孵化,然后用常规养殖方法进行饲养。对于孵化后3个月的各个体立即杀死,为了熟化而在4℃下保存2天或4天。上述保存后,从上述各个体采集骨骼肌,测定上述骨骼肌的重量。上述测定后添加10%的高氯酸,进行匀浆。上述匀浆后,在12900rpm(或15000×g)、10分钟的条件下进行离心分离。在上述离心分离后,获得上清级分。上述获得之后,向上述上清级分中添加1N KOH而中和后,在12900rpm(或15000×g)、10分钟的条件下进行离心分离。上述离心分离后,获得上清级分。然后,将上述上清级分用蒸馏水定容,使用HPLC测定骨骼肌的相对于重量的肌苷酸量(nmol/mg骨骼肌)。上述测定中,使用C18反相柱(4.6mmI.D.×250mm、OTD-80Ts、Tosoh公司制)。将其结果示于下述表2~表3和图1。
[0471] 【表2】
[0472] 对照(+/+)Δ2(+/-)
Δ2(-/-)
Δ5521(+/-)
Δ5521(-/-)


平均
2.10
3.95
3.67
4.43
4.02


SD
0.58
027
0.37
1.07
0.45


SE
0.22
0.10
0.14
0.40
0.17
[0473] 【表3】
[0474] 对照(+/+)Δ2(+/-)
Δ2(-/-)
Δ5521(+/-)


平均
1.83
3.97
3.58
4.07


SD
0.28
0.19
0.25
0.36


SE
O.1O
O.O7
O.O9
O.14
[0475] 图1为示出nt5e基因丧失功能的鳉鱼的肌苷酸量的图。图1中,(A)示出熟化2天后的鳉鱼的肌苷酸量,(B)示出熟化4天后的鳉鱼的肌苷酸量。图1中,横轴表示个体的种类,纵轴表示肌苷酸量。如图1的(A)和上述表2所示,熟化2天后,例子1的鳉鱼Δ2的杂合敲除和纯合敲除这两者和例子2的鳉鱼Δ5521的杂合敲除和纯合敲除这两者,与对照的鳉鱼(野生型的鳉鱼)相比肌苷酸量显著多。另外,如图1的(B)和上述表3所示,熟化4天后,例子1的鳉鱼Δ2的杂合敲除和纯合敲除这两者和例子2的鳉鱼Δ5521的杂合敲除与对照的鳉鱼(野生型的鳉鱼)相比,肌苷酸量显著多。由以上可知,本发明的鳉鱼与野生型的鳉鱼相比,熟化2天后和4天后,肌苷酸的量增加,即通过向nt5e基因导入功能丧失性突变抑制了肌苷酸分解活性。
[0476] [实施例2]
[0477] 制作nt5e基因丧失功能的真鲷,与野生型的真鲷进行比较,确认肌苷酸的分解受到抑制。
[0478] 代替雌雄鳉鱼而使用雌雄真鲷,变更sgRNA,除此以外同样地向nt5e基因中导入突变。真鲷中的sgRNA的基因组上的靶位点为Pm-nt5e基因的外显子6中所存在的下述靶序列。下述靶序列中,3’端侧的下划线所示的3个碱基为原间隔子相邻基序(PAM)序列。
[0479] (外显子6上的靶序列:Pm-Nt5-sgRNA)
[0480] 5'-TCAGGAGGTGGGAAAGACTCTGG-3’(序列号23)
[0481] 接着,使用上述导入后的真鲷的受精卵,除此以外与上述实施例1同样地,将孵化后6个月的各个体立即杀死,经时测定死亡后1、2、3、5、或7天时的肌苷酸量。具体而言,从上述各个体采集骨骼肌,测定上述骨骼肌的重量,。上述测定后,添加10%的高氯酸,进行匀浆。上述匀浆后,在12,900rpm(或15,000g)、10分钟的条件下进行离心分离。上述离心分离后,获得上清级分。上述获得后,向上述上清级分中添加1N KOH进行中和后,在12,900rpm(或15,000g)、10分钟的条件下进行离心分离。上述离心分离后,获得上清级分。然后,将上述上清级分用蒸馏水定容,使用HPLC测定肌苷酸的量。上述测定中,使用C18反相柱(4.6mmI.D.×250mm、OTD-80Ts、Tosoh公司制)。将该结果示于图2。
[0482] 图2为示出nt5e基因丧失功能的真鲷的肌苷酸量的图。图2中,横轴表示死亡后天数(熟化期),纵轴表示肌苷酸量。如图2所示,实施例2的真鲷(突变组)与对照的真鲷(野生型的真鲷、对照组)相比,任一时间点的肌苷酸量均多。由这些可知,本发明的真鲷与野生型的真鲷相比,肌苷酸的分解活性受到抑制。需要说明的是,实施例2的真鲷为使用嵌合个体的结果,但是可知肌苷酸的分解活性受到抑制。因此推测,通过将上述真鲷制成具有杂合型或纯合型的nt5e基因功能丧失体的个体,与上述实施例1的鳉鱼同样地可增加肌苷酸的蓄积。
[0483] [实施例3]
[0484] 制作nt5e基因丧失功能的罗非鱼,分别与野生型的罗非鱼进行比较,确认肌苷酸的分解活性受到抑制和鲜度得到维持。
[0485] 除了代替雌雄鳉鱼而使用雌雄罗非鱼、sgRNA以外,同样地向nt5e基因导入突变。罗非鱼中的sgRNA的基因组上的靶位点为nt5e基因的外显子1中所存在的下述靶序列(序列号5的碱基序列中的第217~239位的碱基序列)。下述靶序列中,5’端侧的下划线所示的3个碱基为原间隔子相邻基序(PAM)序列。
[0486] (外显子1上的靶序列:sgRNA-t)
[0487] 5'-CCCTGCTTCGCTGGTGTGGCCAG-3’(序列号24)
[0488] 接着,使用上述导入后的罗非鱼的受精卵,除此以外与上述实施例1同样地,将孵化后50天的各个体立即杀死,为了熟化而在4℃保存2天或4天。上述保存后,测定上述各个体的核酸(ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx)量。具体而言,从上述各个体采集骨骼肌,测定上述骨骼肌的重量。上述测定后,添加10%的高氯酸,进行匀浆。上述匀浆后,在12900rpm(或15000×g)、10分钟的条件下进行离心分离。上述离心分离后,获得上清级分。上述获得后,向上述上清级分中添加1N KOH进行中和后,在12900rpm(或15000×g)、10分钟的条件下进行离心分离。上述离心分离后,获得上清级分。然后,将上述上清级分用蒸馏水定容,用HPLC测定上述核酸的量。另外,使用上述核酸的测定值和下述式(1)计算作为鲜度指标的K值。上述计算中使用下述计算式。上述测定中,使用C18反相柱(4.6mmI.D.×250mm、OTD-80Ts、Tosoh公司制)。将该结果示于图3。
[0489] (K值的计算式)
[0490] K=(HxR+Hx)/(ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx) ··· (1)
[0491] K:鲜度指标值
[0492] ATP:相对于肌肉重量的腺苷三磷酸的摩尔量
[0493] ADP:相对于肌肉重量的腺苷二磷酸的摩尔量
[0494] AMP:相对于肌肉重量的腺苷一磷酸的摩尔量
[0495] IMP:相对于肌肉重量的肌苷酸的摩尔量
[0496] HxR:相对于肌肉重量的肌苷的摩尔量
[0497] Hx:相对于肌肉重量的次黄嘌呤的摩尔量
[0498] 图3为示出nt5e基因丧失功能的罗非鱼的肌苷酸量和K值的图。图3中,(A)示出熟化2天后的罗非鱼的肌苷酸量,(B)示出熟化4天后的罗非鱼的K值。图3的(A)中,横轴表示个体的种类,纵轴表示肌苷酸量。图3的(B)中,横轴表示个体的种类,纵轴表示K值。如图3的(A)所示,熟化2天后,实施例3的罗非鱼(GE)与对照的罗非鱼(野生型的罗非鱼、WT)相比,肌苷酸量多34%。另外,如图3的(B)所示,熟化4天后,实施例3的罗非鱼(GE)与对照的罗非鱼(野生型的罗非鱼、WT)相比,K值少28%。由以上可知,本发明的罗非鱼与野生型的罗非鱼相比,熟化2天后的肌苷酸的分解活性受到抑制且4天后维持了鲜度。
[0499] 由以上可知,本发明的鱼类与野生型鱼类相比,肌苷酸的分解活性受到抑制且鲜度得到保持。
[0500] [实施例4]
[0501] 制作nt5e基因丧失功能的牙鲆,分别与野生型的牙鲆进行比较,确认肌苷酸的分解活性受到抑制和鲜度得到维持。
[0502] 除了代替雌雄鳉鱼而使用雌雄牙鲆、sgRNA以外,同样地向nt5e基因导入突变。牙鲆中的sgRNA的基因组上的靶位点为nt5e基因的外显子4中所存在的下述靶序列(序列号11的碱基序列中的第605~627位的碱基序列)。下述靶序列中,3’端侧的下划线所示的3个碱基为原间隔子相邻基序(PAM)序列。
[0503] (外显子4上的靶序列:sgRNA-p)
[0504] 5'-CTTCAACGGAGGCGGCGTCCGGG-3’(序列号27)
[0505] 接着,使用上述导入后的牙鲆的受精卵,除此以外与上述实施例1同样地,将受精后546天的各个体立即杀死,为了熟化而在4℃下保存2天。上述保存后,测定上述各个体的核酸(ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx)量。具体而言,与上述实施例2记载的方法同样地实施。将该结果示于图4。
[0506] 图4为示出nt5e基因丧失功能的牙鲆的肌苷酸量和K值的图。图4中,(A)示出熟化2天后的牙鲆的肌苷酸量,(B)示出熟化2天后的牙鲆的K值。图4的(A)中,横轴表示个体的种类,纵轴表示肌苷酸量。图4的(B)中,横轴表示个体的种类,纵轴表示K值。如图4的(A)所示,熟化2天后,实施例4的牙鲆(GE)与对照的牙鲆(野生型的牙鲆、WT)相比,肌苷酸量多8%。另外,如图4的(B)所示,熟化2天后,实施例4的牙鲆(GE)与对照的牙鲆(野生型的牙鲆、WT)相比,K值少37%。由以上可知,本发明的牙鲆与野生型的牙鲆相比,熟化2天后的牙鲆酸的分解活性受到抑制且鲜度得到维持。
[0507] 由以上可知,本发明的鱼类与野生型鱼类相比,抑制肌苷酸的分解活性且可保持鲜度。
[0508] 以上参照实施方式和实施例说明了本发明,但是本发明不受上述实施方式和实施例限定。对于本发明的构成、详细情况,可以在本发明的范畴内进行本领域技术人员可理解的各种变更。
[0509] 本说明书中引用的专利、专利申请和文献,与在本说明书具体地记载其内容本身同样地,将其内容作为本说明书的参考而引入。
[0510] 该申请基于2022年6月15日提出申请的日本申请特愿2022-096417要求优先权,将其公开的全部引入于此。
[0511] <附录>
[0512] 上述的实施方式和实施例的一部分或全部可以如以下的附录那样记载,但是不限于以下。
[0513] <鱼类>
[0514] (附录1)
[0515] 一种鱼类,其胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能。
[0516] (附录2)
[0517] 根据附录1所述的鱼类,其包含nt5e基因功能丧失体,
[0518] 上述功能丧失体为在正常的nt5e基因的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的突变基因。
[0519] (附录3)
[0520] 根据附录2所述的鱼类,其中,上述功能丧失体为在上述正常的nt5e基因的碱基序列中缺失了至少一部分碱基而成的突变基因。
[0521] (附录4)
[0522] 根据附录1至3中任一项所述的鱼类,其包含nt5e基因功能丧失体,
[0523] 上述功能丧失体为相对于正常的nt5e基因的碱基序列包含移码突变的突变基因。
[0524] (附录5)
[0525] 根据附录1至4中任一项所述的鱼类,其包含nt5e基因功能丧失体,
[0526] 上述功能丧失体为相对于正常的nt5e基因的碱基序列包含无义突变的突变基因。
[0527] (附录6)
[0528] 根据附录1至5中任一项所述的鱼类,其包含nt5e基因功能丧失体,上述功能丧失体为在正常的nt5e基因的第1外显子中包含突变的基因。
[0529] (附录7)
[0530] 根据附录2至6中任一项所述的鱼类,上述鱼类为真鲷(Pagrusmajor),
[0531] 上述真鲷的正常的nt5e基因为包含下述(Pn)的多核苷酸的基因:
[0532] (Pn)下述(Pn1)~(Pn7)中的任一多核苷酸:
[0533] (Pn1)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸;
[0534] (Pn2)由在上述(Pn1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0535] (Pn7)编码由相对于序列号2的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0536] (附录8)
[0537] 根据附录2至7中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为真鲷(Pagrus major),
[0538] 上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在正常的nt5e基因的外显子1和外显子6的至少一者中具有突变的突变基因。
[0539] (附录9)
[0540] 根据附录8所述的鱼类,其中,上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子6中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0541] (附录10)
[0542] 根据附录2至9中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为真鲷(Pagrus major),
[0543] 上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在序列号1的碱基序列中的第1014~1036位的碱基中具有突变的突变基因。
[0544] (附录11)
[0545] 根据附录2至6中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0546] 上述红鳍东方鲀的正常的nt5e基因为包含下述(Pt)的多核苷酸的基因:
[0547] (Pt)下述(Pt1)~(Pt7)中的任一多核苷酸:
[0548] (Pt1)由序列号3的碱基序列构成的多核苷酸;
[0549] (Pt2)由在上述(Pt1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0550] (Pt3)由相对于上述(Pt1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0551] (Pt4)由与由上述(Pt1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0552] (Pt5)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0553] (Pt6)编码由在序列号4的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0554] (Pt7)编码由相对于序列号4的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0555] (附录12)
[0556] 根据附录2至6以及11中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0557] 上述红鳍东方鲀包含作为nt5e基因功能丧失体的、在正常的nt5e基因的正常基因的外显子1中具有突变的突变基因。
[0558] (附录13)
[0559] 根据附录12所述的鱼类,其中,上述红鳍东方鲀包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子1中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0560] (附录14)
[0561] 根据附录2至6以及11至13中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0562] 上述红鳍东方鲀中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号3的碱基序列中的第131~153位的碱基中具有突变。
[0563] (附录15)
[0564] 根据附录2至6中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0565] 上述罗非鱼的正常的nt5e基因为包含下述(Po)的多核苷酸的基因:
[0566] (Po)下述(Po1)~(Po7)中的任一多核苷酸:
[0567] (Po1)由序列号5的碱基序列构成的多核苷酸;
[0568] (Po2)由在上述(Po1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0569] (Po3)由相对于上述(Po1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0570] (Po4)由与由上述(Po1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0571] (Po5)编码由序列号6的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0572] (Po6)编码由在序列号6的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0573] (Po7)编码由相对于序列号6的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0574] (附录16)
[0575] 根据附录2至6以及15中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0576] 上述罗非鱼包含作为nt5e基因功能丧失体的、在nt5e基因的正常基因的外显子1中具有突变的突变基因。
[0577] (附录17)
[0578] 根据附录16所述的鱼类,其中,上述罗非鱼包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子1中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0579] (附录18)
[0580] 根据附录2至6以及15至17中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0581] 上述罗非鱼中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号5的碱基序列中的第217~239位的碱基中具有突变。
[0582] (附录19)
[0583] 根据附录2至6中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为牙鲆(Paralichthys olivaceus),
[0584] 上述牙鲆的正常的nt5e基因为包含下述(Pp)的多核苷酸的基因:
[0585] (Pp)下述(Pp1)~(Pp7)中的任一多核苷酸:
[0586] (Pp1)由序列号11的碱基序列构成的多核苷酸;
[0587] (Pp2)由在上述(Pp1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0588] (Pp3)由相对于上述(Pp1)的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0589] (Pp4)由与由上述(Pp1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0590] (Pp5)编码由序列号12的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0591] (Pp6)编码由在序列号12的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0592] (Pp7)编码由相对于序列号12的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0593] (附录20)
[0594] 根据附录2至6以及19中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为牙鲆(Paralichthysolivaceus),
[0595] 上述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在nt5e基因的正常基因的外显子4中具有突变的突变基因。
[0596] (附录21)
[0597] 根据附录20所述的鱼类,其中,上述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子4中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0598] (附录22)
[0599] 根据附录2至6以及19至21中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为牙鲆(Paralichthysolivaceus),
[0600] 上述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在序列号11的碱基序列中的第605~627位的碱基中具有突变。
[0601] (附录23)
[0602] 根据附录2至6中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为革胡子鲶(Clarias garienpinus),
[0603] 上述革胡子鲶的正常的nt5e基因为包含下述(Pq)的多核苷酸的基因:
[0604] (Pq)下述(Pq1)~(Pq7)中的任一多核苷酸:
[0605] (Pq1)由序列号25的碱基序列构成的多核苷酸;
[0606] (Pq2)由在上述(Pq1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0607] (Pq3)由相对于上述(Pq1)的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0608] (Pq4)由与由上述(Pq1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0609] (Pq5)编码由序列号26的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0610] (Pq6)编码由在序列号26的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0611] (Pq7)编码由相对于序列号26的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0612] (附录24)
[0613] 根据附录2至6、8至10、12至14、16至18以及20至22中任一项所述的鱼类,其中,上述功能丧失体编码肌苷酸的分解活性下降的突变NT5E蛋白。
[0614] (附录25)
[0615] 根据附录1至6中任一项所述的鱼类,其中,上述鱼类为选自由鲀科、鲷科、鲑科、鲤科、鮨科、牙鲆科、胡鲇科和慈鲷科组成的组中的鱼类。
[0616] <鱼类的部分>
[0617] (附录26)
[0618] 一种附录1至25中任一项所述的鱼类的部分。
[0619] (附录27)
[0620] 根据附录26所述的鱼类的部分,其中,上述部分为可食用部分。
[0621] <鱼类的生产方法>
[0622] (附录28)
[0623] 一种鱼类的生产方法,其包括下述(a)工序:
[0624] (a)使附录1至25中任一项所述的鱼类与其它鱼类交配的交配工序。
[0625] (附录29)
[0626] 根据附录28所述的生产方法,其包括下述(b)工序:
[0627] (b)从通过上述(a)工序得到的鱼类或其后代品系中选拔胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的鱼类的选拔工序。
[0628] (附录30)
[0629] 根据附录28或29所述的生产方法,其中,在上述(a)工序之前,包括下述(x)工序:
[0630] (x)从对象鱼类中选拔附录1至25中任一项所述的鱼类的工序。
[0631] (附录31)
[0632] 根据附录30所述的生产方法,其中,上述(x)工序中的选拔为包含胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因功能丧失体的鱼类的选拔。
[0633] (附录32)
[0634] 根据附录28或29所述的生产方法,其中,在上述(a)工序之前,包括下述(y)工序:
[0635] (y)由对象鱼类制作附录1至25中任一项所述的鱼类的制作工序。
[0636] <熟化加速的鱼类的生产方法>
[0637] (附录33)
[0638] 一种熟化加速的鱼类的生产方法,
[0639] 其包括使对象鱼类的胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的功能丧失工序。
[0640] (附录34)
[0641] 根据附录33所述的生产方法,其中,在上述功能丧失工序中,向上述对象鱼类的nt5e基因中导入功能丧失性突变而制作包含上述nt5e基因功能丧失体的鱼类。
[0642] (附录35)
[0643] 根据附录34所述的生产方法,其中,上述功能丧失体为在正常的nt5e基因的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的突变基因。
[0644] (附录36)
[0645] 根据附录35所述的生产方法,其中,上述功能丧失体为在上述正常的nt5e基因的碱基序列中缺失了至少一部分碱基而成的突变基因。
[0646] (附录37)
[0647] 根据附录34至36中任一项所述的生产方法,其中,上述功能丧失体为相对于正常的nt5e基因的碱基序列包含移码突变的突变基因。
[0648] (附录38)
[0649] 根据附录34至37中任一项所述的生产方法,其中,上述功能丧失体为相对于正常的nt5e基因的碱基序列包含无义突变的突变基因。
[0650] (附录39)
[0651] 根据附录34至38中任一项所述的生产方法,其中,上述功能丧失体为在正常的nt5e基因的第1外显子中包含突变的突变基因。
[0652] (附录40)
[0653] 根据附录34至39中任一项所述的生产方法,其中,
[0654] 上述鱼类为真鲷(Pagrusmajor),
[0655] 上述真鲷的正常的nt5e基因为包含下述(Pn)的多核苷酸的基因:
[0656] (Pn)下述(Pn1)~(Pn7)中的任一多核苷酸:
[0657] (Pn1)由序列号1中的任一碱基序列构成的多核苷酸;
[0658] (Pn2)由在上述(Pn1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0659] (Pn3)由相对于上述(Pn1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0660] (Pn4)由与由上述(Pn1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0661] (Pn5)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0662] (Pn6)编码由在序列号2的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0663] (Pn7)编码由相对于序列号2的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0664] (附录41)
[0665] 根据附录34至40中任一项所述的生产方法,其中,
[0666] 上述鱼类为真鲷(Pagrusmajor),
[0667] 上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在正常的nt5e基因的外显子6中具有突变的突变基因。
[0668] (附录42)
[0669] 根据附录41所述的生产方法,其中,上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子6中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0670] (附录43)
[0671] 根据附录34至42中任一项所述的生产方法,其中,
[0672] 上述鱼类为真鲷(Pagrusmajor),
[0673] 上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在序列号1的碱基序列中的第1014~1036位的碱基中具有突变的突变基因。
[0674] (附录44)
[0675] 根据附录34至39中任一项所述的生产方法,其中,
[0676] 上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0677] 上述红鳍东方鲀的正常的nt5e基因为包含下述(Pt)的多核苷酸的基因:
[0678] (Pt)下述(Pt1)~(Pt7)中的任一多核苷酸:
[0679] (Pt1)由序列号3中的任一碱基序列构成的多核苷酸;
[0680] (Pt2)由在上述(Pt1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0681] (Pt3)由相对于上述(Pt1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0682] (Pt4)由与由上述(Pt1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0683] (Pt5)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0684] (Pt6)编码由在序列号4的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0685] (Pt7)编码由相对于序列号4的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0686] (附录45)
[0687] 根据附录34至39以及44中任一项所述的生产方法,其中,
[0688] 上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0689] 上述红鳍东方鲀包含作为nt5e基因功能丧失体的、在正常的nt5e基因的正常基因的外显子1中具有突变的突变基因。
[0690] (附录46)
[0691] 根据附录45所述的生产方法,其中,上述红鳍东方鲀包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子1中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0692] (附录47)
[0693] 根据附录34至39以及44至46中任一项所述的生产方法,其中,
[0694] 上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0695] 上述红鳍东方鲀中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号3的碱基序列中的第131~153位的碱基中具有突变。
[0696] (附录43)
[0697] 根据附录34至39中任一项所述的生产方法,其中,
[0698] 上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0699] 上述罗非鱼的正常的nt5e基因为包含下述(Po)的多核苷酸的基因:
[0700] (Po)下述(Po1)~(Po7)中的任一多核苷酸:
[0701] (Po1)由序列号5中的任一碱基序列构成的多核苷酸;
[0702] (Po2)由在上述(Po1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0703] (Po3)由相对于上述(Po1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0704] (Po4)由与由上述(Po1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0705] (Po5)编码由序列号6的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0706] (Po6)编码由在序列号6的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0707] (Po7)编码由相对于序列号6的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0708] (附录49)
[0709] 根据附录34至39以及48中任一项所述的生产方法,其中,
[0710] 上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0711] 上述罗非鱼包含作为nt5e基因功能丧失体的、在nt5e基因的正常基因的外显子1中具有突变的突变基因。
[0712] (附录50)
[0713] 根据附录49所述的生产方法,其中,上述罗非鱼包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子1中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0714] (附录51)
[0715] 根据附录34至39以及48至50中任一项所述的鱼类,其中,
[0716] 上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0717] 上述罗非鱼中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号5的碱基序列中的第217~239位的碱基中具有突变。
[0718] (附录52)
[0719] 根据附录34至39中任一项所述的鱼类,其中,
[0720] 上述鱼类为牙鲆(Paralichthysolivaceus),
[0721] 上述牙鲆的正常的nt5e基因为包含下述(Pp)的多核苷酸的基因:
[0722] (Pp)下述(Pp1)~(Pp7)中的任一多核苷酸:
[0723] (Pp1)由序列号11的碱基序列构成的多核苷酸;
[0724] (Pp2)由在上述(Pp1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0725] (Pp3)由相对于上述(Pp1)的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0726] (Pp4)由与由上述(Pp1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0727] (Pp5)编码由序列号12的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0728] (Pp6)编码由在序列号12的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0729] (Pp7)编码由相对于序列号12的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0730] (附录53)
[0731] 根据附录34至39以及52中任一项所述的鱼类,其中,
[0732] 上述鱼类为牙鲆(Paralichthysolivaceus),
[0733] 上述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在nt5e基因的正常基因的外显子4中具有突变的突变基因。
[0734] (附录54)
[0735] 根据附录53所述的鱼类,其中,上述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子4中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0736] (附录55)
[0737] 根据附录34至39以及52至54中任一项所述的鱼类,其中,
[0738] 上述鱼类为牙鲆(Paralichthysolivaceus),
[0739] 上述牙鲆中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号11的碱基序列中的第605~627位的碱基中具有突变。
[0740] (附录56)
[0741] 根据权利要求34至39中任一项所述的鱼类,其中,
[0742] 上述鱼类为革胡子鲶(Clariasgarienpinus),
[0743] 上述革胡子鲶的正常的nt5e基因为包含下述(Pq)的多核苷酸的基因:
[0744] (Pq)下述(Pq1)~(Pq7)中的任一多核苷酸:
[0745] (Pq1)由序列号25的碱基序列构成的多核苷酸;
[0746] (Pq2)由在上述(Pq1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0747] (Pq3)由相对于上述(Pq1)的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0748] (Pq4)由与由上述(Pq1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0749] (Pq5)编码由序列号26的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0750] (Pq6)编码由在序列号26的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0751] (Pq7)编码由相对于序列号26的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0752] (附录57)
[0753] 根据附录24至29、41至43、45至47、49至51以及53至55中任一项所述的生产方法,其中,上述功能丧失体编码肌苷酸的分解活性下降的突变NT5E蛋白。
[0754] (附录58)
[0755] 根据附录34至57中任一项所述的生产方法,其中,
[0756] 上述制作工序包括:
[0757] 向对象鱼类的nt5e基因中导入突变的导入工序;和
[0758] 从导入了上述突变的对象鱼类中选拔包含上述nt5e基因功能丧失体的鱼类来作为熟化加速的鱼类的选拔工序。
[0759] <鱼肉熟化中的肌苷酸含量的增加方法>
[0760] (附录59)
[0761] 一种鱼肉熟化中的肌苷酸含量的增加方法,其包括使鱼肉熟化的熟化工序,
[0762] 上述鱼肉为附录1至25中任一项所述的鱼类的鱼肉和/或附录26或27所述的鱼类的可食用部分的鱼肉。
[0763] (附录60)
[0764] 根据附录59所述的增强方法,其中,在上述熟化工序中,上述鱼肉的熟化期为1~31天。
[0765] <熟化加速的鱼类的筛选方法>
[0766] (附录61)
[0767] 一种熟化加速的鱼类的筛选方法,其包括从被检鱼类中选拔胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的被检鱼类来作为熟化加速的鱼类的选拔工序。
[0768] (附录62)
[0769] 根据附录61所述的筛选方法,其中,
[0770] 上述选拔工序中,选拔包含nt5e基因功能丧失体的被检鱼类来作为熟化加速的鱼类,
[0771] 上述功能丧失体为在正常的nt5e基因的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的突变基因。
[0772] (附录63)
[0773] 根据附录62所述的筛选方法,其中,上述功能丧失体为在上述正常的nt5e基因的碱基序列中缺失了至少一部分碱基而成的突变基因。
[0774] (附录64)
[0775] 根据附录62至63中任一项所述的筛选方法,其中,在上述选拔工序中,选拔包含nt5e基因功能丧失体的被检鱼类来作为熟化加速的鱼类,
[0776] 上述功能丧失体为相对于正常的nt5e基因的碱基序列包含移码突变的突变基因。
[0777] (附录65)
[0778] 根据附录62至64中任一项所述的筛选方法,其中,
[0779] 在上述选拔工序中,选拔包含nt5e基因功能丧失体的被检鱼类来作为熟化加速的鱼类,
[0780] 上述功能丧失体为相对于正常的nt5e基因的碱基序列包含无义突变的突变基因。
[0781] (附录66)
[0782] 根据附录62至65中任一项所述的筛选方法,其中,
[0783] 在上述选拔工序中,选拔包含nt5e基因功能丧失体的被检鱼类来作为熟化加速的鱼类,
[0784] 上述功能丧失体为在正常的nt5e基因的第1外显子中包含突变的突变基因。
[0785] (附录67)
[0786] 根据附录62至66中任一项所述的筛选方法,其中,
[0787] 上述鱼类为真鲷(Pagrusmajor),
[0788] 上述真鲷的正常的nt5e基因为包含下述(Pn)的多核苷酸的基因:
[0789] (Pn)下述(Pn1)~(Pn7)中的任一多核苷酸:
[0790] (Pn1)由序列号1中的任一碱基序列构成的多核苷酸;
[0791] (Pn2)由在上述(Pn1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0792] (Pn3)由相对于上述(Pn1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0793] (Pn4)由与由上述(Pn1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0794] (Pn5)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0795] (Pn6)编码由在序列号2的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0796] (Pn7)编码由相对于序列号2的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0797] (附录68)
[0798] 根据附录62至67中任一项所述的筛选方法,其中,
[0799] 上述鱼类为真鲷(Pagrusmajor),
[0800] 上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在正常的nt5e基因的外显子6中具有突变的突变基因。
[0801] (附录69)
[0802] 根据附录68所述的筛选方法,其中,上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子6中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0803] (附录70)
[0804] 根据附录62至69中任一项所述的筛选方法,其中,
[0805] 上述鱼类为真鲷(Pagrusmajor),
[0806] 上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在序列号1的碱基序列中的第1014~1036位的碱基中具有突变的突变基因。
[0807] (附录71)
[0808] 根据附录62至66中任一项所述的筛选方法,其中,
[0809] 上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0810] 上述红鳍东方鲀的正常的nt5e基因为包含下述(Pt)的多核苷酸的基因:
[0811] (Pt)下述(Pt1)~(Pt7)中的任一多核苷酸:
[0812] (Pt1)由序列号3中的任一碱基序列构成的多核苷酸;
[0813] (Pt2)由在上述(Pt1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0814] (Pt3)由相对于上述(Pt1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0815] (Pt4)由与由上述(Pt1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0816] (Pt5)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0817] (Pt6)编码由在序列号4的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0818] (Pt7)编码由相对于序列号4的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0819] (附录72)
[0820] 根据附录62至66以及71中任一项所述的筛选方法,其中,
[0821] 上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0822] 上述红鳍东方鲀包含作为nt5e基因功能丧失体的、在正常的nt5e基因的正常基因的外显子1中具有突变的突变基因。
[0823] (附录73)
[0824] 根据附录72所述的筛选方法,其中,上述红鳍东方鲀包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子1中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0825] (附录74)
[0826] 根据附录62至66以及71至73中任一项所述的筛选方法,其中,
[0827] 上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0828] 上述红鳍东方鲀中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号3的碱基序列中的第131~153位的碱基中具有突变。
[0829] (附录75)
[0830] 根据附录62至66中任一项所述的筛选方法,其中,
[0831] 上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0832] 上述罗非鱼的正常的nt5e基因为包含下述(Po)的多核苷酸的基因:
[0833] (Po)下述(Po1)~(Po7)中的任一多核苷酸:
[0834] (Po1)由序列号5中的任一碱基序列构成的多核苷酸;
[0835] (Po2)由在上述(Po1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0836] (Po3)由相对于上述(Po1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0837] (Po4)由与由上述(Po1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0838] (Po5)编码由序列号6的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0839] (Po6)编码由在序列号6的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0840] (Po7)编码由相对于序列号6的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0841] (附录76)
[0842] 根据附录62至66以及75中任一项所述的筛选方法,其中,
[0843] 上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0844] 上述罗非鱼包含作为nt5e基因功能丧失体的、在nt5e基因的正常基因的外显子1中具有突变的突变基因。
[0845] (附录77)
[0846] 根据附录76所述的筛选方法,其中,上述罗非鱼包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子1具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0847] (附录78)
[0848] 根据附录62至66以及75至77中任一项所述的筛选方法,其中,上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0849] 上述罗非鱼中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号5的碱基序列中的第217~239位的碱基中具有突变。
[0850] (附录79)
[0851] 根据附录62至66中任一项所述的筛选方法,其中,
[0852] 上述鱼类为牙鲆(Paralichthysolivaceus),
[0853] 上述牙鲆的正常的nt5e基因为包含下述(Pp)的多核苷酸的基因:
[0854] (Pp)下述(Pp1)~(Pp7)中的任一多核苷酸:
[0855] (Pp1)由序列号11中的任一碱基序列构成的多核苷酸;
[0856] (Pp2)由在上述(Pp1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0857] (Pp3)由相对于上述(Pp1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0858] (Pp4)由与由上述(Pp1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0859] (Pp5)编码由序列号12的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0860] (Pp6)编码由在序列号12的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0861] (Pp7)编码由相对于序列号12的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0862] (附录80)
[0863] 根据附录62至66以及79中任一项所述的筛选方法,其中,
[0864] 上述鱼类为牙鲆(Paralichthysolivaceus),
[0865] 上述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在nt5e基因的正常基因的外显子4中具有突变的突变基因。
[0866] (附录81)
[0867] 根据附录80所述的筛选方法,其中,上述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子4中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0868] (附录82)
[0869] 根据附录62至66以及79至81中任一项所述的筛选方法,其中,
[0870] 上述鱼类为牙鲆(Paralichthysolivaceus),
[0871] 上述牙鲆中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号11的碱基序列中的第605~627位的碱基中具有突变。
[0872] (附录83)
[0873] 根据附录62至66中任一项所述的筛选方法,其中,
[0874] 上述鱼类为革胡子鲶(Clariasgarienpinus),
[0875] 上述革胡子鲶的正常的nt5e基因为包含下述(Pq)的多核苷酸的基因:
[0876] (Pq)下述(Pq1)~(Pq7)中的任一多核苷酸:
[0877] (Pq1)由序列号25的碱基序列构成的多核苷酸;
[0878] (Pq2)由在上述(Pq1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0879] (Pq3)由相对于上述(Pq1)的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0880] (Pq4)由与由上述(Pq1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0881] (Pq5)编码由序列号26的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0882] (Pq6)编码由在序列号26的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0883] (Pq7)编码由相对于序列号26的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0884] <鱼类的生产方法>
[0885] (附录84)
[0886] 一种鱼类的生产方法,其包括从被检鱼类中筛选胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因丧失功能的被检鱼类的筛选工序,
[0887] 上述筛选工序通过附录62至78中任一项所述的筛选方法来实施。
[0888] <鱼类>
[0889] (附录85)
[0890] 一种鱼类,其是附录28至58以及84中任一项所述的生产方法得到的。
[0891] <检测方法>
[0892] (附录86)
[0893] 一种鱼类的熟化加速能力的检测方法,其包括检测被检鱼类中胞外5’-核苷酸酶(nt5e)基因是否丧失功能的检测工序。
[0894] (附录87)
[0895] 根据附录86所述的检测方法,其包括:在上述检测工序中检测上述被检鱼类中是否存在nt5e基因功能丧失体的检测工序。
[0896] (附录88)
[0897] 根据附录87所述的检测方法,其中,上述功能丧失体为在正常的nt5e基因的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的突变基因。
[0898] (附录89)
[0899] 根据附录88所述的检测方法,其中,上述功能丧失体为在上述正常的nt5e基因的碱基序列中缺失了至少一部分碱基而成的突变基因。
[0900] (附录90)
[0901] 根据附录87至89中任一项所述的检测方法,其中,上述功能丧失体为相对于正常的nt5e基因的碱基序列包含移码突变的突变基因。
[0902] (附录91)
[0903] 根据附录87至90中任一项所述的检测方法,其中,上述功能丧失体为相对于正常的nt5e基因的碱基序列包含无义突变的突变基因。
[0904] (附录92)
[0905] 根据附录87至91中任一项所述的检测方法,其中,上述功能丧失体为在正常的nt5e基因的第1外显子中包含突变的突变基因。
[0906] (附录93)
[0907] 根据附录87至92中任一项所述的检测方法,其中,
[0908] 上述鱼类为真鲷(Pagrusmajor),
[0909] 上述真鲷的正常的nt5e基因为包含下述(Pn)的多核苷酸的基因:
[0910] (Pn)下述(Pn1)~(Pn7)中的任一多核苷酸:
[0911] (Pn1)由序列号1中的任一碱基序列构成的多核苷酸;
[0912] (Pn2)由在上述(Pn1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0913] (Pn3)由相对于上述(Pn1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0914] (Pn4)由与由上述(Pn1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0915] (Pn5)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0916] (Pn6)编码由在序列号2的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0917] (Pn7)编码由相对于序列号2的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0918] (附录94)
[0919] 根据附录87至93中任一项所述的检测方法,其中,
[0920] 上述鱼类为真鲷(Pagrusmajor),
[0921] 上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在正常的nt5e基因的外显子6中具有突变的突变基因。
[0922] (附录95)
[0923] 根据附录94所述的检测方法,其中,
[0924] 上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子6中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0925] (附录96)
[0926] 根据附录87至95中任一项所述的检测方法,其中,
[0927] 上述鱼类为真鲷(Pagrusmajor),
[0928] 上述真鲷包含作为nt5e基因功能丧失体的、在序列号1的碱基序列中的第1014~1036位的碱基中具有突变的突变基因。
[0929] (附录97)
[0930] 根据附录87至92中任一项所述的检测方法,其中,
[0931] 上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0932] 上述红鳍东方鲀的正常的nt5e基因为包含下述(Pt)的多核苷酸的基因:
[0933] (Pt)下述(Pt1)~(Pt7)中的任一多核苷酸:
[0934] (Pt1)由序列号3中的任一碱基序列构成的多核苷酸;
[0935] (Pt2)由在上述(Pt1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0936] (Pt3)由相对于上述(Pt1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0937] (Pt4)由与由上述(Pt1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0938] (Pt5)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0939] (Pt6)编码由在序列号4的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0940] (Pt7)编码由相对于序列号4的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0941] (附录98)
[0942] 根据附录87至92以及97中任一项所述的检测方法,其中,
[0943] 上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0944] 上述红鳍东方鲀包含作为nt5e基因功能丧失体的、在正常的nt5e基因的正常基因的外显子1中具有突变的突变基因。
[0945] (附录99)
[0946] 根据附录98所述的检测方法,其中,上述红鳍东方鲀包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子1中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0947] (附录100)
[0948] 根据附录87至92以及97至99中任一项所述的检测方法,其中,
[0949] 上述鱼类为红鳍东方鲀(Takifugurubripes),
[0950] 上述红鳍东方鲀中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号3的碱基序列中的第131~153位的碱基中具有突变。
[0951] (附录101)
[0952] 根据附录87至92中任一项所述的检测方法,其中,
[0953] 上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0954] 上述罗非鱼的正常的nt5e基因为包含下述(Po)的多核苷酸的基因:
[0955] (Po)下述(Po1)~(Po7)中的任一多核苷酸:
[0956] (Po1)由序列号5中的任一碱基序列构成的多核苷酸;
[0957] (Po2)由在上述(Po1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0958] (Po3)由相对于上述(Po1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0959] (Po4)由与由上述(Po1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0960] (Po5)编码由序列号6的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0961] (Po6)编码由在序列号6的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0962] (Po7)编码由相对于序列号6的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0963] (附录102)
[0964] 根据附录87至92以及101中任一项所述的检测方法,其中,
[0965] 上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0966] 上述罗非鱼包含作为nt5e基因功能丧失体的、在nt5e基因的正常基因的外显子1中具有突变的突变基因。
[0967] (附录103)
[0968] 根据附录102所述的检测方法,其中,上述罗非鱼包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子1中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0969] (附录104)
[0970] 根据附录87至92以及101至103中任一项所述的检测方法,其中,
[0971] 上述鱼类为罗非鱼(Oreochromisniloticus),
[0972] 上述罗非鱼中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号5的碱基序列中的第217~239位的碱基中具有突变。
[0973] (附录105)
[0974] 根据附录87至92中任一项所述的检测方法,其中,
[0975] 上述鱼类为牙鲆(Paralichthysolivaceus),
[0976] 上述牙鲆的正常的nt5e基因为包含下述(Pp)的多核苷酸的基因:
[0977] (Pp)下述(Pp1)~(Pp7)中的任一多核苷酸:
[0978] (Pp1)由序列号11中的任一碱基序列构成的多核苷酸;
[0979] (Pp2)由在上述(Pp1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0980] (Pp3)由相对于上述(Pp1)的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0981] (Pp4)由与由上述(Pp1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0982] (Pp5)编码由序列号12的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[0983] (Pp6)编码由在序列号12的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[0984] (Pp7)编码由相对于序列号12的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[0985] (附录106)
[0986] 根据附录87至92以及105中任一项所述的检测方法,其中,
[0987] 上述鱼类为牙鲆(Paralichthysolivaceus),
[0988] 上述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在nt5e基因的正常基因的外显子4中具有突变的突变基因。
[0989] (附录107)
[0990] 根据附录106所述的检测方法,其中,上述牙鲆包含作为nt5e基因功能丧失体的、在上述正常的nt5e基因的外显子4中具有突变且相对于上述正常的nt5e基因的碱基序列具有移码突变或无义突变的突变基因。
[0991] (附录108)
[0992] 根据附录87至92以及105至107中任一项所述的检测方法,其中,
[0993] 上述鱼类为牙鲆(Paralichthysolivaceus),
[0994] 上述牙鲆中,作为nt5e基因功能丧失体,在序列号11的碱基序列中的第605~627位的碱基中具有突变。
[0995] (附录109)
[0996] 根据附录87至92中任一项所述的检测方法,其中,
[0997] 上述鱼类为革胡子鲶(Clariasgarienpinus),
[0998] 上述革胡子鲶的正常的nt5e基因为包含下述(Pq)的多核苷酸的基因:
[0999] (Pq)下述(Pq1)~(Pq7)中的任一多核苷酸:
[1000] (Pq1)由序列号25的碱基序列构成的多核苷酸;
[1001] (Pq2)由在上述(Pq1)的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个碱基而成的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[1002] (Pq3)由相对于上述(Pq1)的碱基序列具有90%以上的同一性的碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[1003] (Pq4)由与由上述(Pq1)的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成、并且编码具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[1004] (Pq5)编码由序列号26的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸;
[1005] (Pq6)编码由在序列号26的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸;
[1006] (Pq7)编码由相对于序列号26的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、并且具有肌苷酸分解活性的蛋白质的多核苷酸。
[1007] (附录110)
[1008] 根据附录87至92、94至96、98至100、102至104以及106至108中任一项所述的检测方法,其中,上述功能丧失体编码肌苷酸的分解活性下降的突变NT5E蛋白。
[1009] <加工食品>
[1010] (附录111)
[1011] 一种鱼类的加工食品,其使用附录1至25以及85中任一项所述的鱼类。
[1012] 产业上的可利用性
[1013] 如上所述,本发明的鱼类可加速熟化。因此,本发明例如在鱼类的育种领域、水产领域等中极为有用。