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西番莲PeCWINV5基因及其应用
申请号	CN202410902317.8	申请日	2024-07-06	公开(公告)号	CN118792324A	公开(公告)日	2024-10-18
申请人	中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所;			发明人	黄东梅; 吴斌; 邢文婷; 宋顺; 许奕; 马伏宁; 李洪立; 胡文斌; 黄海杰;
摘要	本发明提供了一种西番莲PeCWINV5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供了首次从西番莲中克隆获得西番莲PeCWINV5基因，在低温、高温等胁迫下西番莲中PeCWINV5基因转录水平上调，说明该基因能够提高植物的抗非生物胁迫的能力等，研究显示该基因能够显著提高酵母低温、高温等胁迫下的生存能力，提高果肉中果浆可溶性固形物以及果糖、葡萄糖、蔗糖等可溶性糖的含量等。本发明为提高酵母和植物抗抗逆性、改善果实风味等方面的研究提供新的候选基因。
权利要求	1.一种西番莲PeCWINV5基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 2.如权利要求1所述西番莲PeCWINV5基因编码的蛋白质。 3.含有权利要求1所述西番莲PeCWINV5基因编码区的重组载体或宿主菌或表达盒。 4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1304表达载体，西番莲PeCWINV5基因编码区位于pCAMBIA1304表达载体的NcoI和SpeI两限制性内切酶位点之间。 5.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pYES2表达载体，西番莲PeCWINV5基因编码区位于pYES2表达载体的SacI和EcoRI两限制性内切酶位点之间。 6.如权利要求1所述的西番莲PeCWINV5基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3-5中任意一项所述的重组载体或宿主菌或表达盒在提高酵母耐低温性、和/或耐高温性中的应用。 7.如权利要求1所述的西番莲PeCWINV5基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3-5中任意一项所述的重组载体或宿主菌或表达盒在提高植物耐低温性、和/或耐高温性中的应用。 8.如权利要求1所述的西番莲PeCWINV5基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3-5中任意一项所述的重组载体或宿主菌或表达盒在提高PeCWINV5的表达量中的应用。 9.如权利要求1所述的西番莲PeCWINV5基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3-5中任意一项所述的重组载体或宿主菌或表达盒在提高果肉中果浆可溶性固形物、和/或果糖、和/或葡萄糖、和/或蔗糖中的应用。 10.一种引物对，其特征在于，所述引物对为ATGTTTGCAGGACCCATGATCTA和TCAGTTGATACGAGCTGTCTTCATG；或者所述引物对为上游引物acgggggactcttgacagatctATGTTTGCAGGACCCATGATCTA和下游引物cagtgaaaagttcttctcctttactagtGTTGATACGAGCTGTCTTCATG；或者所述引物对为上游引物cttggtaccgagctcgg ATGTTTGCAGGACCCATGATCTA和下游引物ctgcagaattccagcacac TCAGTTGATACGAGCTGTCTTCATG。
说明书全文	西番莲PeCWINV5基因及其应用技术领域 [0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种西番莲PeCWINV5基因及其应用。背景技术 [0002] 西番莲又称百香果、鸡蛋果，是西番莲科西番莲属多年生常绿藤本植物，是热带及亚热带的特色水果，因其果味香浓，含有上百种芳香物质，可以散发出菠萝、芒果、荔枝、香蕉、草莓等多种水果的香味而得名百香果。百香果口感酸甜、果汁丰富、营养丰富、口感和风味独特，有“果汁之王”的美誉。据测定，西番莲汁含有100多种挥发性化合物，可溶性固形物含量高达10-25％，有机酸、氨基酸、维生素和矿物质元素含量均十分丰富，是果汁饮料和食品极佳的调味物。除了食用，西番莲还是一种传统的药用果实，具有丰富的医药保健功能，如活血强身、滋阴补肾、生津止渴等，此外还具有抗焦虑、镇静、抗炎、抗成瘾等治疗作用。近年来，市场对西番莲的需求显著增加，产业发展迅速，截止至2021年全国百香果种植面积已突破100万亩，年产量达到100万吨，产值超过100亿元。 [0003] 糖酸是西番莲果实品质的重要组成部分，其含量高低影响着果实风味，是果实鲜食品质中的重要指标。西番莲果实中的可溶性糖主要为果糖、葡萄糖、蔗糖，其三者含量占总糖比例达99.41％，而有机酸主要为柠檬酸，其含量占总酸比例达84.56％。糖酸的种类、含量及比例是对果实品质和口感影响最大的因素，在很大程度上决定了果实的商品价值，一直以来深受人们关注，也是广大科研工作者一直致力于改良的重要指标之一。 [0004] 由于西番莲的应用越来越广泛，其分子生物学的研究也不断深入和发展，基因表达分析也逐渐应用于揭示西番莲基因表达和调控的机理。通过挖掘分析影响糖酸品质性状的基因，验证其功能并开发其应用价值，可以为西番莲品种改良和选育提供了候选的基因资源，对于西番莲产业的发展具有积极的促进作用。发明内容 [0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种西番莲PeCWINV5基因及其应用。 [0006] 本发明的第一个方面是提供一种西番莲PeCWINV5基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。 [0007] 本发明的第二个方面是提供如本发明第一个方面所述西番莲PeCWINV5基因编码的蛋白质。 [0008] 本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述西番莲PeCWINV5基因编码区的重组载体。 [0009] 其中，所述重组载体原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体为pUCI-Blunt Zero载体、pCAMBIA1304表达载体和pYES2表达载体，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。 [0010] 优选地，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1304表达载体，西番莲PeCWINV5基因编码区位于pCAMBIA1304表达载体的NcoI和SpeI两限制性内切酶位点之间。 [0011] 优选地，所述重组载体的原始载体为pYES2表达载体，西番莲PeCWINV5基因编码区位于pYES2表达载体的SacI和EcoRI两限制性内切酶位点之间。 [0012] 本发明的第四个方面是提供含有第一个方面所述西番莲PeCWINV5基因编码区的宿主菌。 [0013] 本发明的第五个方面是提供含有本发明第一个方面所述西番莲PeCWINV5基因编码区的表达盒。 [0014] 本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeCWINV5基因、或者如本发明第二个方面所述的西番莲转录因子PeCWINV5、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高酵母耐低温性、和/或耐高温性中的应用。 [0015] 本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeCWINV5基因、或者如本发明第二个方面所述的西番莲转录因子PeCWINV5、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高植物耐低温性、和/或耐高温性中的应用。 [0016] 本发明的第八个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeCWINV5基因、或者如本发明第二个方面所述的西番莲转录因子PeCWINV5、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高PeCWINV5的表达量中的应用。 [0017] 本发明的第九个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeCWINV5基因、或者如本发明第二个方面所述的西番莲转录因子PeCWINV5、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高果肉中果浆可溶性固形物、和/或果糖、和/或葡萄糖、和/或蔗糖中的应用。 [0018] 本发明的第十个方面是提供一种引物对，所述引物对为ATGTTTGCAGGACCCATGATCTA和TCAGTTGATACGAGCTGTCTTCATG；或者所述引物对为上游引物acgggggactcttgacagatctATGTTTGCAGGACCCATGATCTA和下游引物cagtgaaaagttcttctcctttactagtGTTGATACGAGCTGTCTTCATG；或者所述引物对为上游引物cttggtaccgagctcggATGTTTGCAGGACCCATGATCTA和下游引物ctgcagaattccagcacacTCAGTTGATACGAGCTGTCTTCATG。 [0019] 本发明提供了首次从西番莲中克隆获得西番莲PeCWINV5基因，在低温、高温等胁迫下西番莲中PeCWINV5基因转录水平上调，说明该基因能够提高植物的抗非生物胁迫的能力等，研究显示该基因能够显著提高重组酵母低温、高温等胁迫下的生存能力，提高果肉中果浆可溶性固形物以及果糖、葡萄糖、蔗糖等可溶性糖的含量等。本发明为提高酵母和植物抗抗逆性、改善果实风味等方面的研究提供新的候选基因。附图说明 [0020] 图1为西番莲PeCWINV5基因在不同组织部位的表达情况。 [0021] 图2为西番莲PeCWINV5基因在不同非生物胁迫下的表达情况。 [0022] 图3为西番莲PeCWINV5基因在三个果实成熟期的表达情况。T1：采收前两周，果皮未完全转色；T2：果实成熟采收期，果皮完全转为紫红色；T3：采收后一周，果皮有些许皱缩。 [0023] 图4为转PeCWINV5基因酿酒酵母工程菌在低温(左)和高温胁迫(右)处理后的生长情况(10-1、10-2、10-3分别对应稀释10倍、100倍、1000倍)。 [0024] 图5为西番莲pCAMBIA1304-PeCWINV5重组载体示意图及瞬时转化GUS染色图。 [0025] 图6为PeCWINV5基因瞬时转化西番莲果实后果肉中PeCWINV5基因的表达情况。 [0026] 图7为PeCWINV5基因瞬时转化西番莲果实后果肉中果浆可溶性固形物(左)及可溶性糖(右)含量变化。具体实施方式 [0027] 下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 [0028] 实施例1：西番莲PeCWINV5基因的克隆 [0029] 提取紫果西番莲果浆总RNA，采用Trizol法提取获得总RNA。使用RevertAidFirstStrand cDNA Synthesis Kit(K1622)反转录试剂盒对RNA进行反转录获得cDNA。以cDNA第一链为模板，以ATGTTTGCAGGACCCATGATCTA和TCAGTTGATACGAGCTGTCTTCATG为引物，进行PCR扩增反应。反应体系为PrimeSTAR Max Premix(2x)10μl,5’端引物1μl，3’端引物1μl，模板2μl，加双蒸水补足20μl。扩增条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸30s，共30个循环。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后利用胶回收试剂盒切胶回收，利用TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(上海生工)连接至克隆载体pUCI-Blunt Zero，转至大肠杆菌感受态DH5α，对单克隆进行PCR鉴定，选取鉴定阳性的单克隆摇菌并提取质粒，得到pUCI-BluntZero-PeCWINV5质粒，送至生工测序公司测序分析，结果显示克隆获得西番莲PeCWINV5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 [0030] 实施例2：西番莲PeCWINV5基因在不同组织部位的表达分析 [0031] 为研究PeCWINV5在不同组织中的表达特性，取紫果西番莲7个组织部位cDNA，定量TGTTTGCAGGACCCATGATC和TTGTGCGGTGTCCAGTTAAC为引物，采用Takara TBPremixEx TaqTMII荧光定量PCR试剂，使用2－ΔΔCt方法计算相对表达量，检测PeCWINV5的表达水平。结果显示PeCWINV5在果实中的表达量最高，其次是花瓣和雄蕊，在茎中的表达量最低(图1)。这说明PeCWINV5可能与果实发育密切相关。 [0032] 实施例3：西番莲PeCWINV5基因在不同非生物胁迫下的的表达分析 [0033] 选取生长约2个月，生长健壮且具有8-10片功能叶的紫果西番莲幼苗用于干旱、盐、低温和高温胁迫处理： [0034] ①干旱胁迫：将植株进行干旱处理，当土壤水分为50％和10％时分别取样； [0035] ②盐处理：用300mM的盐溶液处理3d和10d后分别取样； [0036] ③低温处理：将植株置于0℃环境中24h和48h后分别取样； [0037] ④高温处理：将植株置于45℃环境中2h、4h和24h后分别取样。 [0038] 将西番莲进行干旱、高温、低温、高盐胁迫下处理并取样进行转录组测序分析，利用转录组数据研究PeCWINV5在以上四种非生物胁迫下的表达谱。结果显示，PeCWINV5响应低温和高温的胁迫影响，处理后表达水平均显著提升(图2)。 [0039] 实施例4：西番莲PeCWINV5基因在三个果实成熟期的表达分析 [0040] 选取紫果西番莲果实成熟阶段三个时期期果浆(T1，采收前两周，果皮未完全转色；T2果实成熟采收期，果皮完全转为紫红色；T3采收后一周，果皮有些许皱缩)取样并进行转录组测序分析，利用转录组数据研究PeCWINV5在三个果实成熟时期的表达谱。结果显示，随着果实发育及果实成熟度的增加，PeCWINV5的表达量呈现高水平表达且呈上调趋势，在T3时期表达水平最高(图3)，推断为参与西番莲果实的糖积累的关键候选基因。 [0041] 实施例5：PeCWINV5基因在酵母中的不同非生物胁迫下的功能验证 [0042] 以pUCI-Blunt Zero-PeCWINV5质粒为模板，采用上游引物cttggtaccgagctcggATGTTTGCAGGACCCATGATCTA(下划线为SacI酶切位点)和下游引物ctgcagaattccagcacacTCAGTTGATACGAGCTGTCTTCATG(下划线为EcoRI酶切位点)进行PCR扩增，反应体系为2xPrimeSTAR Max Premix 25μl,上游引物2μl，下游引物2μl，模板5μl，加双蒸水补足50μl。扩增条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，67℃退火5s，72℃延伸30s，共30个循环。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后利用胶回收试剂盒切胶回收获得目的DNA片段。采用BamHI将pYES2载体线性化。利用Seamless cloning Master Mix试剂盒(上海生工)，将目的DNA片段和线性化载体以3:1摩尔比加到PCR管中进行重组反应，反应体系为2×Seamless cloningMaster Mix 10μl，线性化载体2μl，插入片段6μl，加双蒸水补足20μl。50℃反应20min。反应结束后，立即将离心管置于冰上冷却2min，取4μl反应产物转化大肠杆菌感受态DH5α，对单克隆进行PCR鉴定，选取鉴定阳性的单克隆摇菌并提取质粒(pYES2-PeCWINV5质粒)。采用热激法将pYES2-PeCWINV5及对照pYES2质粒转至酿酒酵母INVSc1感受态细胞(唯地生物)，并经菌液PCR验证。 [0043] 对转化成功的酵母挑取单克隆在SD-Ura液体培养基中摇菌，30℃ 150rpm震荡培养16h以上至稳定生长期，再按照1:100的比例接种于新的培养基继续培养至OD600＝1.0，收集酵母菌体进行非生物胁迫处理，处理如下： [0044] ①低温处理：-20℃处理0h，12h，24h，36h，48h，60h； [0045] ②高温处理：30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，每个温度处理2h。 [0046] 胁迫处理后将菌体分别稀释10倍、100倍、1000倍后取3μL涂于酵母SD-Ura固体培养平板上，每个处理重复三次。 [0047] 结果如图4所示。低温胁迫处理0-2h，PeCWINV5酵母工程菌与对照相比生长速率接近，而从12h开始，PeCWINV5酵母工程菌的生长情况明显比对照要好，由此推断PeCWINV5在酿酒酵母中异源表达提高了酵母的耐低温能力。高温胁迫处理结果显示，pYES2-PeCWINV5转化的酵母株在35℃及以上处理中，其生长情况均比对照菌株要好，由此推断PeCWINV5在酿酒酵母中异源表达提高了酵母的对高温的耐受能力。 [0048] 实施例6：转PeCWINV5基因拟南芥 [0049] 1、过表达载体构建 [0050] 以pUCI-Blunt Zero-PeCWINV5质粒为模板，采用上游引物acgggggactcttgacagatctATGTTTGCAGGACCCATGATCTA(下划线为BglII酶切位点)和下游引物cagtgaaaagttcttctcctttactagtGTTGATACGAGCTGTCTTCATG(下划线为SpeI酶切位点)，参照酵母表达载体构建方法进行PCR扩增、电泳及片段回收。采用NcoI和SpeI将pCAMBIA1304表达载体线性化。参照酵母表达载体构建方法进行片段连接、转化和PCR鉴定，选取鉴定阳性的单克隆摇菌并提取质粒(pCAMBIA1304-PeCWINV5质粒)。 [0051] 2、瞬时转化西番莲果实 [0052] 将pCAMBIA1304-PeCWINV5转化农杆菌感受态细胞EHA105并经菌液PCR确认获得侵染工程菌。挑取工程菌单克隆于YEB液体培养基(含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平)中28℃震荡培养至OD600＝0.8-1.0，4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，用MES缓冲液(10mMMES，10mM MgCl2，200μMAs，pH 5.6)重悬，使OD600＝0.6-0.8后，在28℃恒温摇床中孵育3h用于瞬时侵染。 [0053] 选取近成熟期且生长一致的健康果实进行PeCWINV5瞬时过表达试验。侵染前流水冲洗果实表面，并用75％擦拭果实表面并用无菌水冲洗干净，晾干后用于侵染。将果实纵切成相等的两半，一半注射相同体积的悬浮液作为对照。侵染完成后用保鲜膜封装好，放置于26℃恒温培养箱中培养。3d后取果浆进行GUS染色、PeCWINV5表达量测定、可溶性固形物测定和可溶性糖含量测定。 [0054] GUS染色：取侵染后的果肉，剪成单个果粒，放置于5mL离心管中，加入GUS染色液至完全覆盖材料，锡纸包好常温染色过夜。染色结果后将材料转至70％酒精中脱色并进行结果观察。结果显示，过表达PeCWINV5的西番莲果肉经过GUS染色后均变成了蓝色(图5)，表明外源基因已成功导入果肉细胞中并成功表达。 [0055] PeCWINV5表达量测定：提取侵染果肉总RNA，参照实施案例1方法反转录成cDNA后作为模板，采用荧光定量PCR法测定PeCWINV5表达量，检测瞬时转化效果。荧光定量试剂为TBPremix Ex TaqTMII(Takara)，以延伸因子EF1α为内参，PeCWINV5上游引物TGTTTGCAGGACCCATGATC和下游引物TTGTGCGGTGTCCAGTTAAC；EF1α上游引物ACCACCAAGTACTACTGCACTG，下游引物ATAAGCACGGCACAATCAGC。采用法计算相对表达量。荧光定量测定结果表明，过表达处理的果肉中PeCWINV5的表达量高于对照处理(图6)。 [0056] 可溶性固形物测定：采用ATAGO糖度仪进行可溶性固形物测定。结果显示，与对照相比，过表达PeCWINV5处理的果浆可溶性固形物有明显提高(图7)。 [0057] 可溶性糖含量测定：将侵染后的果肉进行匀浆并离心，吸取上清0.22μm滤膜过滤后采用HPLC法进行可溶性糖含量测定。HPLC工作条件为ZORBAX NH2色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为乙腈-水(75:25，V/V)，流速1mL/min，柱温为30℃，进样量为10微升，检测器为示差折光检测器。采用标准品绘制标准曲线进行定量。结果显示，PeCWINV5过表达处理的果肉中果糖、葡萄糖和蔗糖含量均高于对照处理(图7)。表明PeCWINV5具有促进果糖和葡萄糖等己糖积累，还有可能具有促进蔗糖转运和卸载的作用。 [0058] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。