用作抗氧化剂的取代的苯酚和苯硫酚

冠心病(CHD)现已成为工业化国家主要的死亡原因。尽管最近的 CHD死亡率有所下降，在美国，每年仍有超过500,000人死于CHD。 据估计，美国一年直接和间接花在CHD上的费用超过一千亿美元。 CHD的主要原因是动脉粥样硬化，这是一种以脂质在动脉管壁中的沉 积为特征的疾病，从而导致管道狭窄，最终使血管系统硬化。

动脉粥样硬化(由其主要的临床并发症缺血性心脏病所表现出 来)被认为是开始于动脉内皮的局部损伤，然后，动脉平滑肌细胞 从中间层向内膜层增生，同时伴有脂质的沉积和泡沫细胞在损伤处 的蓄积。随着动脉粥样硬化斑的进展，越来越多的血管逐渐被阻塞， 最后可导致局部缺血或梗塞。因此，提供一种在患者需要的时候抑 制动脉粥样硬化进展的方法正是人们所需要的。

血胆甾醇过多是一种重要的与CHD有关的危险因素。例如在1984 年12月，一个健康共同发展协会研究小组国家研究所得出结论说， 降低血浆胆甾醇水平(特别是低密度脂蛋白胆甾醇的血液水平)无 疑会减少CHD引起的心脏病发作的危险。血清脂蛋白是脂质循环的 载体。根据它们的密度分类如下：乳糜微粒、极低密度脂蛋白 (VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。乳糜微粒主要 参与饮食中甘油三酯和胆甾醇从肠向脂肪组织与肝脏的转移。VLDL 将内源性合成的甘油三酯从肝脏释放到脂肪与其他组织中。LDL将胆 甾醇转移至外周组织，并调节这些组织中的内源性胆甾醇水平。HDL 将胆甾醇从外周组织转移至肝脏。动脉壁胆甾醇几乎全部来自LDL (Brown和Goldstein，《生物化学年鉴》(Ann.Rev.Biochem.)52, 223(1983)；Miller，《医学年鉴》(Ann.Rev.Med.)31,97(1980))。 在低水平LDL患者中，很少发生动脉粥样硬化。因此，需要提供一 种降低血胆甾醇过多患者或具有形成血胆甾醇过多危险的患者血浆 胆甾醇的方法。

提高的胆甾醇水平也与大量疾病状态有关，包括再狭窄、绞痛、 脑动脉硬化和黄瘤。需要提供一种降低患者血浆胆甾醇的方法，该 患者患有再狭窄、绞痛、脑动脉硬化、黄瘤和其他与胆甾醇水平提 高有关的疾病状态或具有形成这些疾病的危险。

血管细胞粘着分子-1(VCAM-1)和细胞间粘着分子-1(ICAM-1) 是属于免疫球蛋白超家族的粘着分子，它们在血管内皮细胞和平滑 肌细胞中被细胞因子例如白介素-1(IL-1)、白介素-4(IL-4)和肿 瘤坏死因子-α(TNF-α)上调。在炎性反应中，通过与适当的整合蛋 白反受体的相互作用，VCAM-1和ICAM-1介导白细胞粘着作用与跨 内皮的移行作用。VCAM-1和/或ICAM-1的抑制剂对多种类型的慢性 炎症具有治疗学上的应用，包括动脉粥样硬化、哮喘、类风湿性关 节炎和自身免疫性糖尿病。例如，对患者动脉粥样硬化斑的原位杂 交与免疫组织化学分析证明，粘着分子(VCAM-1和ICAM-1)的水平 高于非疾病区。O’Brien,K.D．等《临床研究杂志》 (J.Clin.Invest.)92,945-951(1993)；Davies,M.J．等《病 理学杂志》(J.Pathol.)171,223-229(1993)；Poston,R.N． 等《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)140,665-673(1992)。致 动脉粥样化的饮食诱发了粉瘤兔子主动脉内皮和血管平滑肌细胞中 的VCAM-1表达。Poston,R.N．等，出处同上；Cybulsky,M.I． 等《科学》(Science)251,788-791(1991)；Li,H．等《动脉硬 化与血栓形成》(Arterioscler.Thromb.)13,197-204(1993)。 鉴于以前所作的这些研究，提高了的VCAM-1表达据信是与动脉粥样 硬化斑的起始与进展有关的，这是通过循环中的单核细胞向损伤区 的募集反应来实现的。

而且，VCAM-1作为一种介体，也涉及其他慢性炎症，例如哮喘、 类风温性关节炎和自身免疫性糖尿病。例如，已知VCAM-1和ICAM-1 的表达在哮喘症中是升高的。Pilewski,J.M．等《美国呼吸细胞分 子生物学杂志》(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.)12,1-3(1995)； Ohkawara,Y．等《美国呼吸细胞分子生物学杂志》12,4-12(1995)。 另外，阻断VCAM-1和ICAM-1的整合蛋白受体(分别为VLA-4和 LFA-1)抑制了卵白蛋白致敏的大鼠气道变态反应模型的早期和晚期 反应。Rabb,H.A．等《美国呼吸护理医学杂志》(Am.J.Respir.Care Med.)149,1186-1191(1994)。包括VCAM-1在内的内皮粘着分子 在风湿病样滑膜的微脉管系统中的表达也是升高的。Koch,A.E． 等《实验室研究》(Lab.Invest.)64,313-322(1991)； Morales-Ducret,J．等《免疫学》(Immunol.)149,1421-1431 (1992)。抗VCAM-1或其反受体VLA-4的中和抗体能够延迟自发产生 糖尿病的小鼠模型(NOD小鼠)疾病的发病。Yang,X.D．等《美国 国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90,10494-10498 (1993)；Burkly,L.C．等《糖尿病》(Diabetes)43,523-534(1994)； Baron,J.L．等《临床研究杂志》93,1700-1708(1994)。VCAM-1 的单克隆抗体对同种移植排斥反应的动物模型也具有有益效果，这 表明VCAM-1表达的抑制剂可用于预防移植排斥反应。Orocz,C.G． 等《免疫学快报》(Immunol.Lett.)32,7-12(1992)。

由细胞所表达的VCAM-1既可以是膜结合的形式，也可以是可溶 的形式。VCAM-1的可溶形式显示具有体外诱导血管内皮细胞趋化性 的作用和刺激大鼠角膜血管生成应答的作用。KoCh,A.E．等《自然》 (Nature)376,517-519(1995)。可溶VCAM-1表达的抑制剂在具 有强血管生成成分的疾病治疗中具有潜在的治疗学价值，这类疾病 包括肿瘤的生长和转移。Folkman,J.和Shing,Y．《生物学与化学 杂志》(J.Biol.Chem.)10931-10934(1992)。

VCAM-1和ICAM-1的启动子都已被克隆，并进行了特征描述。例 如，两者的启动子都含有多DNA序列元件，它们能够与转录因子 NF-kB结合。Iademarco,M.F．等《生物学与化学杂志》267, 16323-16329(1992)；Voraberger,G．等《免疫学杂志》 (J.Immunol.)147,2777-2786(1991)。NF-kB族转录因子在位于 炎症部位内上调的若干基因的调节中处于核心地位。NF-kB活化为 转录因子涉及在细胞质中从抑制性亚基IkB的离解过程。NF-kB亚 基易位至核，与特异性DNA序列元件结合，激活若干基因的转录， 包括VCAM-1和ICAM-1。Collins T．等《实验室研究》68,499-508 (1993)。

已经假定，通过特异性还原-氧化(redox)敏感的转录调节因 子或转录后调节因子，可以将VCAM-1基因表达的调节与氧化应力联 系起来。抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯和N-乙酰半胱氨酸抑制 血管内皮细胞中细胞因子诱导的VCAM-1表达，但不是ICAM-1。Mauri, N．等《临床研究杂志》92,1866-1874(1993)。这一点说明，抗氧 化剂对VCAM-1表达的抑制作用涉及某些在ICAM-1表达调节中所不 涉及的另外的因子。

Parker等在1992年10月13日公布的美国专利5,155,250号中 公开了作为抗动脉粥样硬化剂的2,6-二烷基-4-甲硅烷基-苯酚。进 一步地，于1995年6月15日公开的PCT国际申请WO 95/15760号 公开了作为血清胆甾醇降低剂的2,6-二烷基-4-甲硅烷基-苯酚。

它将有助于控制VCAM-1和/或ICAM-1的释放，并治疗以VCAM- 1和/或ICAM-1为媒介的作用。它还将有助于控制或治疗慢性炎症， 而不会产生已知的伴随使用抗炎甾类化合物和非甾类化合物抗炎剂 产生的伴发副作用。

本发明提供了下式化合物 其中 X选自 ，或

Y为硫基、氧基或一个亚甲基；

Z为氢或-C(O)-(CH2)m-Q，其中Q为氢或-COOH,m为一个1、2、 3或4的整数；

R1为C1-C6烷基；且

R2、R3和R4每个独立为氢或C1-C6烷基；

或其一种立体异构体。

本发明还提供了一种在患者需要时抑制LDL脂质过氧化的方 法，该方法包括将有效抗氧化量的式(1)化合物对所述患者给药。

本发明进一步提供了一种在患者需要时降低血浆胆甾醇水平的 方法，该方法是通过将血浆胆甾醇降低量的式(1)化合物给药来实现 的。

本发明进一步提供了一种在患者需要时抑制动脉粥样硬化进展 的方法和/或治疗动脉粥样硬化的方法，该方法包括将抗动脉粥样硬 化量的式(1)化合物对该患者给药。

本发明进一步提供了一种在患者需要时抑制细胞因子诱导的血 管细胞粘着分子-1和/或细胞间粘着分子-1的表达的方法，该方法 包括将有效的血管细胞粘着分子-1和/或细胞间粘着分子-1抑制量 的式(1)化合物对该患者给药。

本发明进一步提供了一种治疗患有慢性炎性疾病的患者的方 法，该方法包括将治疗学上有效量的式(1)化合物对该患者给药。

本申请中所用的： a)符号“ ”指的是一条伸向页面前方的键； b)符号“ ”指的是一条伸向页面后方的键；

c)符号“—”指的是一条非手性分子间的键或一条手性分子间 的键，其立体化学没有指明。

本文所用的术语“C1-C6烷基”指的是一个由一至六个碳原子组 成的直链、支链或环状构型的饱和烃基。包括在该术语范围内的有 甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、 正戊基、正己基、环己基等等。

术语“立体异构体”是单个分子所有异构体的通称，它们的区别 仅在于其原子在空间的取向不同。它包括镜像异构体(对映体)、 几何(顺/反式)异构体、和具有一个以上手性中心的化合物的异构 体，它们彼此不是镜像(非对映体)。

式(1)化合物可以采用为本领域的普通技术人员所熟知和领会 的步骤和工艺进行制备。一个制备式(1)化合物的一般性合成流程如 下流程A所示，其中的所有取代基除非另有说明，均为前述所定义 的。 流程A

Y’=S或O

Hal=氯、溴或碘

一般来说，结构1a的苯酚可以通过下述方法制备：使适当的结 构2的烷基-4-巯基苯酚或烷基氢醌(或适当的被保护的衍生物)与 一种非亲核性碱(如氢化钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠、氢氧化 钾等等)以及适当的结构3的卤代烷或卤代烯反应(如适当的溴代 烷)反应，反应在一种适当的非质子传递溶剂(如乙腈、二甲基甲 酰胺或二甲基乙酰胺)中进行，或者在一种含水溶剂(如水/2-丁酮) 中进行。

按照标准的酰化工艺，使结构1a的苯酚酰化，可以制得结构1b 的苯酚酯。例如，将结构1a的苯酚溶于一种适当的非质子传递溶剂， 如乙腈、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺，或者溶于一种醚性溶剂， 如二乙醚或二噁烷，并用一种适当的碱处理，如三乙胺、N-甲基吗 啉、氢氧化钠或氢化钠。然后在室温下加入过量的O-酰化剂，反应 物在室温下搅拌1至24小时。O-酰化剂的例子为乙酰氯、丙酰氯、 一乙基琥珀酰氯、琥珀酸酐等等。产物然后用本领域熟知的工艺进 行精制，如萃取法和急骤色谱法。可选地，可以另外再用一种适当 的碱处理，如氢氧化钠，随后用一种适当的酸进行酸化，如氢氯酸， 然后进行萃取和急骤色谱法，以得到结构1b的苯酚酯。

用于流程A所概述的一般合成过程中的原料对本领域的普通技 术人员来说是易于得到的。例如，下列专利描述了制备其中Z为硫 的不同式(1)化合物所需的某些苯酚原料，如2,6-二叔丁基-4-巯基 苯酚和2-叔丁基-4-巯基苯酚：美国专利3,576,883、美国专利 3,952,064、美国专利3,479,407、美国专利4,975,467、美国专利 5,155,250和日本专利申请73-28425。其他制备式(1)化合物所需的 苯酚原料包括三甲基氢醌、叔丁基-1,4-氢醌和2,5-二叔丁基氢醌， 它们是商业上可得到的。

结构3的卤代烷和卤代烯原料，如(R)-(-)-香茅基溴、(S)-(+)- 香茅基溴、1-溴-3,7-二甲基辛烷、1-溴-3-甲基丁烷和4-溴-2-甲 基-2-丁烯，都是商业上可得到的。

在特例中，X是如下式的部分： 或 适当的由式(3a)或(3b)代表的结构3的中间体 是通过下述方法制备的：在室温下，一边搅拌一边向3-甲基-1,3- 丁二醇或羟基香茅醇、溴化锂、2,4,6-可力丁和二甲基甲酰胺的混 合物中加入甲磺酰氯。混合物搅拌数天，用水和乙醚稀释，并采用 本领域熟知的工艺萃取，得到结构(3a)或(3b)的中间体。

若在反应条件下，结构2化合物的1-苯酚官能度可与结构3化 合物反应，在这种情况中，结构2化合物的1-苯酚官能度可以用本 领域熟知和领会的标准苯酚保护剂保护住。具体保护基团的选择和 使用对本领域的普通技术人员来说是熟知的。一般来说，所选择的 保护基团应当足以在随后的合成步骤中保护住所述的苯酚，并且在 一定条件下是易于除去的，该条件不会导致所需产物降解。

适当的苯酚保护基团的例子是醚，如甲氧基甲基、2-甲氧基乙 氧基甲基、四氢吡喃基、叔丁基和苄基；甲硅烷基醚，如三甲甲硅 烷基和叔丁基二甲硅烷基；酯，如乙酸酯和苯甲酸酯；碳酸酯，如 碳酸甲酯和碳酸苄基酯；以及磺酸盐，如甲磺酸盐和甲苯磺酸盐。

若R1和R2均为叔丁基，在这种情况中，流程A的反应可以便利 地进行，无需保护1-苯酚官能度。

下列实施例描述了如流程A所述典型的合成方法。这些实施例被 理解为仅供举例说明之用，无论如何不是对本发明范围的限制。这 里所用的下列术语具有所示含义：“g”指克；“mol”指摩尔；“mmol” 指毫摩尔；“L”指升；“mL”指毫升；“bp”指沸点；“℃”指摄 氏度；“mmHg”指毫米汞柱；“mp”指熔点；“mg”指毫克；“μM” 指微摩尔；“μg”指微克；“h”或“hrs”指小时；“min”指分钟。

实施例1 苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]-，(S)-

将2,6-二叔丁基-1,4-氢醌(9.0g,40.5mmol)、碳酸钾(5.6g)、 S-(+)-香茅基溴(8.9g,40.5mmol,Aldrich)和乙腈(150mL，在氩气 下脱气)混合，加热回流，并在氩气下搅拌四天。用水冷稀释混合物， 并用二乙醚萃取。用水洗涤醚层，并蒸发至干，得到一种油(14.5g)。 在球状管(kugelrohr)中蒸馏该油。在收集其他馏分之前，可以收集 原料(2.5g,130℃,0.1mmHg)。由另外收集的一种馏分(140-165 ℃,0.1mmHg)得到一种油(11.7g)，然后在硅胶上进行色谱法处理 (氯仿)。在球状管上重蒸馏(135-150℃,0.1mmHg)，得到一种淡 黄色油(11.4g)。 分析计算值C24H40O2:C,79.94；H,11.18 实测值：C,80.55；H,11.17

实施例2 苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-， (S)-

将叔丁基-1,4-氢醌(4.2g,25.8mmol,Aldrich)、碳酸钾 (3.5g)、S-(+)-香茅基溴(5.5g,25.1mmol)和乙腈(150mL，在氩气下 脱气)混合，加热回流，并在氩气下搅拌四天。用水冷稀释混合物， 并用二乙醚萃取。用水洗涤醚层，并蒸发至干，得到一种油(7.9g)。 在球状管中蒸馏该油。在收集其他馏分之前，可以收集原料(1.6g，至 120℃,0.1mmHg)。由另外收集的馏分(140-165℃,0.1mmHg)得到 一种油(5.8g)，然后在硅胶上进行色谱法处理(氯仿)。在球状管 上重蒸馏(138-170℃,0.1mmHg)该油，然后在硅胶上进行色谱法分 析(己烷-CH2Cl23∶1-1∶1)。残余产物在球状管上重蒸馏(140-150℃, 0.1mmHg)，最后再重蒸馏一次(138-150℃,0.1mmHg)，得到标题 化合物(4.0g)。 分析计算值C20H32O2:C,78.89；H,10.60 实测值：C,79.51；H,10.44

实施例3 苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-， (S)-

将2-叔丁基-4-巯基苯酚(8.0g,44mmol)、碳酸氢钾(4.4g, 44mmol)、碳酸钾(0.1g)、S-(+)-香茅基溴(9.6g,44mmol)和异丙醇 (150mL，在氩气下脱气)混合，加热回流，并在氩气下搅拌约0.5 hrs。蒸馏除去H2O·异丙醇的共沸物，继续将混合物回流过夜约24 小时。用蒸馏法除去溶剂(蒸汽浴)。用H2O稀释残余物，用浓氢 氯酸酸化，并用二乙醚萃取。用水和盐水洗涤醚层，并蒸发至干， 得到一种油(16.2g)。在球状管中蒸馏该油。在收集其他馏分之前， 可以收集原料(3.5g,120℃,0.25-0.1mmHg)。由另外收集的馏分 (130-140℃,0.1mmHg)得到一种油(9.7g)，重蒸馏(135-160℃,0.1 mmHg)，得到一种无色油(9.4g)。 分析计算值C20H32OS:C,74.94；H,10.06；S,10.01 实测值：C,75.40；H,10.19

实施例4 苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫 基]-，

将2,6-二叔丁基-4-巯基苯酚(10.0g,41.9mmol)、R-(-)-香茅 基溴(9.2g,8.3mL,41.9mmol)和异丙醇(150mL，在氩气下脱气)的混 合物在室温、正压氩气下搅拌。加入碳酸氢钾(4.2g,41.9mmol)， 在搅拌下将混合物回流过夜。蒸馏除去异丙醇，加入乙腈(～ 100mL)，将反应混合物回流约1hr，蒸馏除去乙腈。用水稀释反应 混合物，用浓氢氯酸酸化，并用二乙醚萃取。用水和盐水洗涤醚层， 通过硅胶/Na2SO4过滤，并蒸发至干，得到一种淡黄色油(16.2g)。 在球状管中蒸馏该油。在收集其他馏分之前，可以收集一种黄色油 馏分(1.6g,120℃,0.25-0.1mmHg)。由另外收集的馏分(140-165 ℃,0.1mmHg)得到一种无色油(13.9g)，将其在球状管上重蒸馏 (140-160℃,0.1mmHg)，得到一种无色油(13.7g)。 分析计算值C24H40OS:C,76.53；H,10.71 实测值：C,76.42；H,10.77

实施例5 苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-，

将二叔丁基-1,4-氢醌(10.0g,45mmol)、溴-3,7-二甲基辛烷 (10.0g,45mmol)、碳酸钾(6.22g,45mmol)和乙腈(200mL，在氩气 下脱气)混合，在搅拌、氩气下加热回流，并蒸馏除去溶剂，直至反 应混合物的温度达到82℃。将反应混合物在氩气下另外回流三天。 用水冷稀释混合物，并用二乙醚萃取。用水洗涤醚层，并蒸发至于， 得到一种油(16.6g)。在球状管中蒸馏该油。在收集其他馏分之前， 可以收集原料(5.0g,～65-110℃,0.1mmHg)。由另外收集的馏分 (135-155℃,0.1mmHg)得到一种油(12.0g)，然后在硅胶上进行色 谱法处理(氯仿)。将该油在球状管上重蒸馏(138-170℃,0.1 mmHg)，然后在硅胶上进行色谱法处理(CHCl3)，得到一种油 (11.7g)。所得产物在球状管上重蒸馏(130-145℃,0.1mmHg)，得 到一种油(10.7g)，最后再重蒸馏一次(130-145℃,0.1mmHg)，得 到标题化合物(10.1g)。 分析计算值C24H42O2:C,79.50；H,11.68 实测值：C,80.24；H,11.88

实施例6 苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-，

在正压氩气下，将2-叔丁基氢醌(8.3g,0.05mol)和二甲基乙酰 胺(100mL)的混合物在冰浴中搅拌。加入氢化钠(2.0g,60％油分散系， 0.05mol)，并将反应混合物搅拌1hr(和/或H2气停止放出)。加 入1-溴-3,7-二甲基辛烷(11.1g,0.05mol)，并使混合物温度升至 室温。使所生成的沉淀溶解(～3hrs)。在室温下搅拌该暗褐色混合 物过夜，用H2O和二乙醚稀释。萃取醚层，洗涤并蒸发至干，得到 一种棕色半固体产物(16.4g)。在球状管中蒸馏该棕色半固体产物。 在收集其他馏分之前，可以收集原料(3.4g，至120℃,0.1mmHg)。 由一种收集到的产物馏分(～130-155℃,0.1mmHg)得到一种油(～ 6.5g)。收集另一种产物馏分(150-185℃,0.1mmHg)得到一种油(～ 4.1g)。合并这两种产物馏分(～6.5g+～4.1g)，以及从前次同例 另外收集到的产物馏分(～4.6g)，并蒸发至干，得到一种油(～ 15.5g)。该油用硅胶色谱法精制，用己烷(500mL)、CCl4∶己烷(500mL, 1∶1)和CCl4连续洗脱，得到一种草色油(9.2g)。在球状管中重蒸馏 该草色油，收集到标题化合物(7.9g,135-150℃,0.1mmHg)。

实施例7 苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(7-羟基-3,7-二甲基辛基)硫 基]-，

步骤a：结构(3a)的制备

将羟基香茅醇(10.0g,57.4mmol)、溴化锂(10.0g, 111.5mmol)、2,4,6-可力丁(7.0g,7.6mL,57.7mmol)和二甲基甲 酰胺(100mL)混合，并在室温下搅拌。历时大约五分钟加入甲磺酰氯 (6.6g,4.44mL,57.4mmol)，混合物在室温下搅拌过夜。再加入溴 化锂(5.0g)、甲磺酰氯(4.4mL)和2,4,6-可力丁(7.6mL)，混合物搅 拌四天。混合物用H2O和乙醚稀释，萃取醚层，用饱和Cu(NO3)2和水 洗涤，并蒸发至干，得到标题化合物，为一种淡黄色油(8.7g, 37mmol)。

步骤b：MDL 104,487的制备

合并实施例7步骤a的产物与2,6-二叔丁基-4-巯基苯酚(8.8g, 37mmol)、碳酸氢钾(3.7g,37mmol)和异丙醇(100mL)的混合物，并 加热回流。继续将混合物回流一小时，并蒸馏除去溶剂，直至反应 混合物的温度达到82℃。用H2O稀释反应混合物，用浓氢氯酸酸化， 并用二乙醚萃取。用水和盐水洗涤醚层，通过硅胶/Na2SO4过滤，并 蒸发至干，得到一种油(37.0g)。在球状管中蒸馏该油。在收集其他 馏分之前，可以收集原料(～100-130℃,0.1mmHg)。由另外收集的 馏分(160-175℃,0.1mmHg)得到一残余物(13.8g)。该残余物用硅 胶色谱法精制，用CCl4、CCl4∶CH2Cl2(1∶1)和CH2Cl2连续洗脱， 得到标题化合物，为一种黄色油(10.6g)。 分析计算值C24H42O2S:C,73.04；H,10.73 实测值：C,73.19；H,10.92

实施例8 苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]-，(R)-

              (MDL 104 535)

将2,6-二叔丁基-1,4-氢醌(6.7g,30mmol)、R-(-)-香茅基溴 (6.6g,6.0mL,30mmol)和乙腈(150mL，在氩气下脱气)的混合物在室 温下搅拌，并加入碳酸钾(4.2g,30mmol)。在正压氩气下将混合物 加热回流过夜。再将反应混合物回流24小时，加入碘化钾，另外再 回流～6hrs。将反应混合物冷却至室温，用水稀释，用浓氢氯酸酸 化，用二乙醚萃取，通过硅胶/Na2SO4过滤，并蒸发至干，得到一种 油(11.0g)。在球状管中蒸馏该油。收集馏分(10.8g,120-130℃,0.1 mmHg和150-180℃,0.1mmHg)，并在球状管中重蒸馏该油。由另外 收集的馏分(160-175℃,0.1mmHg)得到一残余物(13.8g)。收集原 料(2.2g，最高120℃,0.1mmHg)和标题化合物，为一种淡黄色油 (8.3g,135-150℃,0.1mmHg)。 分析计算值C24H40O2:C,79.94；H,11.18 实测值：C,79.96；H,11.10

实施例9 苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，

将2-叔丁基氢醌(7.0g,42mmol)、R-(-)-香茅基溴(9.2g, 42mmol)和乙腈(150mL，在真空下脱气)的混合物在室温下搅拌。加入 碳酸钾(5.8g,42mmol)，并在搅拌、正压氩气下将混合物回流过夜。 加入碘化钾(2.0g)，并继续回流三天。将反应混合物冷却至室温， 用水稀释，用浓氢氯酸酸化，用二乙醚萃取，通过硅胶/Na2SO4过滤， 并蒸发至干，得到一种油(13.0g)。在球状管中蒸馏该油。收集原料 (1.3g，最高120℃,0.1mmHg)。由另外收集的馏分(140-170℃,0.1 mmHg)得到一残余物(8.9g)，将其重蒸馏，收集(7.5g,140-160℃, 0.1mmHg)，并用硅胶色谱法精制，用CHCl3洗脱，得到标题化合物， 为一种淡黄色油(7.1g)。 分析计算值C20H32O2:C,78.89；H,10.60 实测值：C,79.73；H,10.86

实施例10 苯酚，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]-，(S)-

将2,5-二叔丁基-1,4-氢醌(11.1g,50mmol)、S-(+)-香茅基溴 (11.0g,50mmol)、碳酸钾(6.9g)和乙腈(150mL，在氩气下脱气)的混 合物在搅拌下加热回流两天。加入二甲基甲酰胺(～15mL)和碘化钠 (～0.5g)，并继续回流过夜。将反应混合物冷却至室温，用水稀释， 用浓氢氯酸酸化，用二乙醚萃取，通过硅胶/Na2SO4过滤，并蒸发至 干，得到一种油(19.2g)。将该油与己烷混合。过滤所生成的沉淀。 将滤液蒸发至干，在球状管中蒸馏残余物。收集原料(最高120℃, 0.1mmHg)。收集另外的馏分(155-180℃,0.1mmHg)，得到一种油 (9.2g)，将其用硅胶色谱法精制(己烷∶CH2Cl2∶4∶1)，并蒸发至干， 得到一种淡草色油(8.4g)。在球状管中重蒸馏该淡草色油，得到标 题化合物，为一种油(8.2g,150-165℃,0.1mmHg)。 分析计算值C24H40O2:C,79.94；H,11.18 实测值：C,80.68；H,11.08

实施例11

丁酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基辛基)氧基]苯 基酯

将实施例5产物(4.9g,13.5mmol)和氢化钠(0.6g，在油中60％, 15mmol)在二甲基乙酰胺(100mL)中的混合物在室温下搅拌1小时。 在搅拌下向反应混合物中加入一乙基琥珀酰氯(2.46g,15mmol)。反 应混合物在室温下搅拌过夜，然后在90℃下加热2小时，再冷却。 用水稀释混合物，并用乙醚萃取。用水洗涤醚层，并蒸发至干，得 到一残余物。将残余物与甲醇(100mL)混合，并加热回流。加入氢氧 化钠(1.0g，在20mL水中)，并将反应混合物回流30分钟，然后用 水稀释，并冷却。用浓氢氯酸酸化该水悬液，并用乙醚和四氢呋喃 萃取该混合物。分离有机层，并蒸发至干，得到从己烷中结晶出的 标题化合物。

实施例12 乙酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基] 苯基酯，(S)-

将实施例1的产物(6.02g,16.7mmol)、氢化钠(0.67g，在油中 60％,16.7mmol)和二甲基乙酰胺(50mL)的混合物在室温下搅拌30分 钟。向反应混合物中缓慢加入乙酰氯(2.6g,33.5mmol)，继续反应 过夜。用水和乙醚稀释反应混合物，并分离各层。蒸发醚层至干， 得到粗的标题化合物。在球状管中蒸馏，然后进行重结晶，得到标 题化合物。

实施例13 乙酸，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]苯基 酯

在室温下搅拌实施例9的产物(4.67g,15.3mmol)、三乙胺 (3.04g,30mmol)和乙醚(100mL)的混合物。在搅拌下缓慢加入乙酰 氯(2.4g,30mmol)。混合物搅拌4小时，然后用水稀释。分离各层 并蒸发有机层至干，得到一残余物。在球状管中蒸馏该残余物，得 到标题化合物。

实施例14 丙酸，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基] 苯基酯，(S)-

在室温下搅拌实施例10的产物(7.21g,20mmol)、三乙胺(2.53g, 25mmol)在乙醚(150mL)中的混合物。加入丙酰氯(23g,25mmol)，混 合物搅拌过夜。加入水和乙醚，并分离各层。蒸发有机层，得到一 种油，然后将其在球状管中蒸馏。残余物可用硅胶色谱法精制，得 到标题化合物。

实施例15 丁酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基] 苯基酯

在室温下搅拌实施例4的产物(7.53g,20mmol)、三乙胺(2.53g, 25mmol)在乙醚(150mL)中的混合物。加入丁酰氯(2.66g,25mmol)， 混合物搅拌过夜。加入水和乙醚，并分离各层。蒸发有机层，得到 -种油，然后将其在球状管中蒸馏。残余物可用硅胶色谱法精制， 得到标题化合物。

实施例16 苯酚，2,3,6-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，(S)-

将三甲基氢醌(10.0g,66mmol,Aldrich化学公司，Milwaukee, WI 53233)、S-(+)-香茅基溴(14.47g,66mmol)、碳酸钾(9.12g, 66mmol)、碘化钠(9.9g)和乙腈(150mL)的混合物加热回流，并搅拌 五天。混合物冷却，用水和乙醚稀释，并分离各层。蒸发有机层至 干，得到一种油。在球状管中蒸馏该油。残余物用硅胶色谱法精制， 并重蒸馏，得到标题化合物。

实施例17 苯酚，2,3,5-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，(S)-

对上述实施例16的反应产物进行色谱法处理，然后蒸馏，得到 标题化合物。

实施例18 苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3-甲基-2-丁烯基)硫基]-，

用4-溴-2-甲基-2-丁烯(6.25g,41.9mmol)按照实施例4方法进 行制备。在球状管中蒸馏，得到标题化合物。

实施例19 苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3-甲基丁烷)氧基]-，

用1-溴-3-甲基丁烷(7.55g,0.05mol)按照实施例6方法进行制 备。在球状管中蒸馏，得到标题化合物。

实施例20 乙酸，2,3,6-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]苯基酯， (S)-

步骤a：4-乙酰氧基-2,3,5-三甲基苯酚的制备

在冰浴中搅拌三甲基氢醌(15.2g,0.1mol)、三乙胺(25.3g, 0.25mol)和乙醚(500mL)的混合物。在搅拌下缓慢加入乙酰氯(19.6g, 0.25mol)，使反应物温度升至室温一小时，然后用水稀释，并分离 各层。蒸发醚层至干。将所得二乙酸酯溶于甲醇(300mL)。加入强氢 氧化铵(11mL)，并在室温下搅拌混合物过夜。在减压下蒸馏除去溶 剂，并将残余物溶于乙醚。用水洗涤醚层，并蒸发至干。从己烷-乙 醚中重结晶，得到4-乙酰氧基-2,3,5-三甲基苯酚(16.7g, m.p.=106-107℃)。

步骤b：乙酸，2,3,6-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基] 苯基酯，(S)-的制备

在搅拌下，将4-乙酰氧基-2,3,5-三甲基苯酚(8.1g, 41.7mmol)、S-(+)-香茅基溴(9.14g,41.7mmol)、溴化锂(3.6g, 41.7mmol)、碳酸钾(5.8g,41.7mmol)和乙腈(150mL)的混合物加热 回流三天。冷却混合物，用水稀释，用浓氢氯酸酸化，并萃取入乙 醚中。蒸发醚层至干，得到一残余物。蒸馏该残余物，然后进行硅 胶色谱法处理，得到标题化合物。

按照类似于上述实施例1-20的方法，可以制得下列化合物：

苯酚，2,6-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，

苯酚，2,6-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，(S)-，

苯酚，2,6-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，(R)-，

苯酚，2,6-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-，

苯酚，2,6-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-，(S)-，

苯酚，2,6-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-，(R)-，

苯酚，2,6-二乙基-4-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-，

苯酚，2,6-二乙基-4-[(7-羟基-3,7-二甲基辛基)氧基]-，

苯酚，2,5-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，

苯酚，2,5-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，(S)-，

苯酚，2,5-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，(R)-，

苯酚，2,5-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-，

苯酚，2,5-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-，(S)-，

苯酚，2,5-二乙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-，(R)-，

苯酚，2,5-二乙基-4-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-，

苯酚，2,5-二乙基-4-[(7-羟基-3,7-二甲基辛基)氧基]-，

苯酚，2,6-二丙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，

苯酚，2,6-二丙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，(S)-，

苯酚，2,5-二丙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，(R)-，

苯酚，2,5-二丙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-，

苯酚，2,6-二异丙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-， (S)-，

苯酚，2,6-二异丙基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-， (R)-，

苯酚，2,5-二异丙基-4-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-，

苯酚，2,5-二异丙基-4-[(7-羟基-3,7-二甲基辛基)氧基]-，

苯酚，2,3,6-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，

苯酚，2,3,6-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-， (R)-，

苯酚，2,3,6-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-，

苯酚，2,3,6-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-， (S)-，

苯酚，2,3,6-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-， (R)-，

苯酚，2,3,6-三甲基-4-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-，

苯酚，2,3,6-三甲基-4-[(7-羟基-3,7-二甲基辛基)氧基]-，

苯酚，2,3,5-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-，

苯酚，2,3,5-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧基]-， (R)-，

苯酚，2,3,5-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-，

苯酚，2,3,5-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-， (S)-，

苯酚，2,3,5-三甲基-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基]-， (R)-，

苯酚，2,3,5-三甲基-4-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-，

苯酚，2,3,5-三甲基-4-[(7-羟基-3,7-二甲基辛基)氧基]-，

苯酚，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3-甲基-2-丁烯基)硫 基]-，

苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3-甲基-2-丁烯基)硫基]-，

苯酚，2,3,6-三甲基-4-[(3-甲基-2-丁烯基)硫基]-，

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3-甲基丁基)氧基]-，

苯酚，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3-甲基丁基)氧基]-，

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3-羟基-3-甲基丁基)氧 基]-，

乙酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]苯基酯，

乙酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]苯基酯，(R)-，

乙酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫 基]苯基酯，

乙酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫 基]苯基酯，(S)-，

乙酸，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基] 苯基酯，(R)-，

乙酸，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基辛基)氧基]苯 基酯，

乙酸，2,3,6-三甲基-4-[(7-羟基-3,7-二甲基辛基)氧基]苯基 酯，

丙酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]苯基酯，

丙酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]苯基酯，(R)-，

丙酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫 基]苯基酯，

丙酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫 基]苯基酯，(S)-，

丙酸，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基] 苯基酯，(R)-，

丙酸，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基辛基)氧基]苯 基酯，

丁酸，2,3,6-三甲基-4-[(7-羟基-3,7-二甲基辛基)氧基]苯基 酯，

丁酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]苯基酯，

丁酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]苯基酯，(R)-，

丁酸，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫 基]苯基酯，

丁酸，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫 基]苯基酯，(S)-，

丁酸，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫基] 苯基酯，(R)-，

丁酸，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基辛基)氧基]苯 基酯，

丁酸，2,3,6-三甲基-4-[(7-羟基-3,7-二甲基辛基)氧基]苯基 酯。

一个制备其中Z为亚甲基的式(1)化合物的一般性合成流程如下 流程B所示，其中的所有取代基除非另有说明，均为前述所定义的。

                     流程B Hal=氯、溴或碘

一般来说，按照流程B，可用两步法制备结构1c的苯酚。在步 骤a中，适当的结构3的卤代烷或卤代烯在一种适当的非质子传递 溶剂(如乙醚)中与金属镁反应，生成镁的卤化物盐。镁的卤化物 盐(格利雅试剂)然后与适当的结构4的烷基-4-羟基苯甲醛(或适 当的被保护的衍生物)反应，得到结构5的醇。在步骤b中，通过 本领域熟知和领会的各种还原工艺和过程可将结构5的醇还原为所 需的结构1b的苯酚。例如，使其在液氨中与钠反应，借助此Birch 还原反应，可将结构5的醇还原。

按照前面流程A所述的标准酰化反应工艺，可通过酰化结构1c 的苯酚来制备结构1d的苯酚酯。

用于流程B所概述的一般合成过程中的原料是易于得到的，或者 按照标准工艺和过程是易于制备的。为了防止发生所不需要的副反 应，可以在格利雅反应之前，用前面流程A所述的标准苯酚保护剂 保护流程B中结构4的烷基-4-羟基苯甲醛的1-苯酚官能度。

下列实施例描述了如流程B所述典型的合成方法。这些实施例被 理解为仅供举例说明之用，无论如何不是对本发明范围的限制。

实施例21 苯酚，2,3,6-三甲基-4-(4,8-二甲基-7-壬烯基)-，(R)- 步骤a：

在惰性气氛下，将镁屑(240mg,10mmol)与无水乙醚混合。加入 S-(+)-香茅基溴(2.19g,10mmol)的无水乙醚溶液。搅拌直至金属镁 溶解。加入2,3,5-三甲基-4-羟基苯甲醛(1.7g,10mmol)的无水乙 醚溶液。搅拌直至反应完全。将反应混合物冷却至0℃，加入饱和氯 化铵溶液。分离醚层，用水洗涤并干燥(MgSO4)。蒸发得到适当的结 构5的中间体，用硅胶色谱法精制。

步骤b：

将金属钠(520mg,22.6mmol)与液氨(13mL)混合。向该溶液中滴 加实施例19步骤a的中间体(3.04g,10mmol)的乙醇(0.5g)与乙醚 (5mL)溶液。蓝色消失后，小心地加入水(13mL)，用乙醚萃取，干燥 (MgSO4)，并蒸发溶剂。用硅胶色谱法精制残余物，得到标题化合物。

或者，也可按照下述流程C方法制备其中Z为亚甲基的式(1)化 合物，其中的所有取代基除非另有说明，均为前述所定义的。

                       流程C

一般来说，结构1b的苯酚可按下述方法制备：首先，适当的结 构3的卤代烷或卤代烯与金属镁在一种适当的非质子传递溶剂(如 乙醚)中反应，生成镁的卤化物盐。镁的卤化物盐(格利雅试剂) 然后与适当的结构6的烷基-4-羟基苄基卤(或适当的被保护的衍生 物)反应，得到所需的结构1c的苯酚。

按照前面流程A所述的标准酰化反应工艺，可通过酰化结构1c 的苯酚来制备结构1d的苯酚酯。

用于流程C所概述的一般合成过程中的原料是易于得到的，或者 按照标准工艺和过程是易于制备的。例如，3,5-二甲基-4-乙酰氧基 苄基溴的制备描述在《四面体》(Tetrahedron)33,3097-103(1977) 中。通过标准的水解步骤，3,5-二甲基-4-乙酰氧基苄基溴可转化为 相应的苯酚原料。

为了防止发生所不需要的副反应，可以在格利雅反应之前，用前 面流程A所述的标准苯酚保护剂保护流程C中结构6的烷基-4-羟基 苄基卤的1-苯酚官能度。

下列实施例描述了如流程C所述典型的合成方法。这些实施例被 理解为仅供举例说明之用，无论如何不是对本发明范围的限制。

实施例22 苯酚，2,6-二乙基-4-(4,8-二甲基-7-壬烯村)-，(R)-

在惰性气氛下，将镁屑(240mg,10mmol)与无水乙醚混合。加入 S-(+)-香茅基溴(2.19g,10mmol)的无水乙醚溶液。搅拌直至金属镁 溶解。加入4-溴甲基-2,6-二乙基苯酚(2.43g,10mmol)的无水乙醚 溶液，并回流该混合物直至反应完全。倒在冰/氢氯酸的混合物上， 并分离各层。用水洗涤醚层，干燥(MgSO4)并蒸发，得到用硅胶色谱 法精制的标题化合物。

实施例23 乙酸，2,6-二乙基-4-[(4,8-二甲基-7-壬烯基)-，(R)-

在室温下搅拌实施例20的产物(6.05g,20mmol)、三乙胺(2.53g, 25mmol)在乙醚(150ml)中的混合物。加入乙酰氯(1.96g,25mmol)， 并搅拌该混合物过夜。加入水和乙醚，并分离各层。蒸发有机层， 得到一种油，将其在球状管中蒸馏。硅胶色谱法(氯仿)得到标题 化合物。

按照类似于上述实施例21-23的方法，可制备下列化合物：

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基-7-壬烯基)-，

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基-7-壬烯基)-， (R)-，

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基-7-壬烯基)-， (S)-，

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基壬基)-，

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基壬基)-， (R)-，

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基壬基)-， (S)-，

苯辛醇，3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基-α,α,ε-三甲基-，

苯辛醇，3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基-α,α,ε-三甲基-， (R)-，

苯辛醇，3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基-α,α,ε-三甲基-， (S)-，

苯酚，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基-7-壬烯基)-，

苯酚，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基-7-壬烯基)-， (R)-，

苯酚，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基-7-壬烯基)-， (S)-，

苯酚，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基壬基)-，

苯酚，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基壬基)-， (R)-，

苯酚，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基壬基)-， (S)-，

苯辛醇，3,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基-α,α,ε-三甲基-，

苯辛醇，3,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基-α,α,ε-三甲基-， (R)-，

苯辛醇，3,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基-α,α,ε-三甲基-， (S)-，

苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基-7-壬烯基)-，

苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基-7-壬烯基)-， (R)-，

苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基-7-壬烯基)-， (S)-，

苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基壬基)-，

苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基壬基)-,(R)-，

苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲基壬基)-,(S)-，

苯辛醇，3-(1,1-二甲基乙基)-4-羟基-α,α,ε-三甲基-，

苯辛醇，3-(1,1-二甲基乙基)-4-羟基-α,α,ε-三甲基-，(R)-，

苯辛醇，3-(1,1-二甲基乙基)-4-羟基-α,α,ε-三甲基-，(S)-，

苯辛醇，4-(乙酰氧基)-3,5-双(1,1-二甲基乙基)-α,α,ε-三甲 基-，

苯辛醇，4-(乙酰氧基)-3,5-双(1,1-二甲基乙基)-α,α,ε-三甲 基-，(R)-，

苯辛醇，4-(乙酰氧基)-3,5-双(1,1-二甲基乙基)-α,α,ε-三甲 基-，(S)-，

苯辛醇，4-(乙酰氧基)-3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲 基-7-壬烯基)-，

苯辛醇，4-(乙酰氧基)-3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲 基-7-壬烯基)-，(R)-，

苯辛醇，4-(乙酰氧基)-3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-(4,8-二甲 基-7-壬烯基)-，(S)-。

式(1)化合物被理解为可以以不同立体异构体的形式存在。按照 标准的立体异构体结构表达惯例的解释，与上述结构式一致的所有 的立体异构体形式均包括在本发明的范围内。

优选的式(1)化合物是那些化合物，其中Z为氢、乙酰基或琥珀 酰基，优选为氢；R1为甲基或叔丁基；R2与R3每个独立为氢、甲基 或叔丁基；R4为氢或甲基。更优选的化合物是：

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]-，(S)-，

苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]-，(S)-，

苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫 基]-，(S)-，

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)硫 基]-，

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基辛基)氧 基]-，

苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基辛基)硫基]-，

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(7-羟基-3,7-二甲基辛基) 硫基]-，

苯酚，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]-，(R)-，

苯酚，2-(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]-，和

苯酚，2,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-[(3,7-二甲基-6-辛烯基)氧 基]-，(S)-。

本文所用的术语“患者”指的是一种温血动物或哺乳动物，需要 治疗其慢性炎性疾病、动脉粥样硬化、血胆甾醇过多或者需要抑制 其细胞因子诱导的血管细胞粘着分子-1和/或细胞间粘着分子-1的 表达。豚鼠、犬、猫、大鼠、小鼠、仓鼠、兔和灵掌类(包括人) 被理解为该术语含义范围内的患者的例子。

动脉粥样硬化是一种以动脉粥样化损害或斑的形成与生长为特 征的疾病状态。这类需要治疗其动脉粥样硬化的患者的判断恰好是 在本领域的普通技术人员的能力和知识范围内。例如，患有临床上 明显的动脉粥样硬化或面临形成临床上明显的动脉粥样硬化危险的 个体即为有必要进行动脉粥样硬化治疗的患者。利用临床化验、体 格检查和病历/家族史，本领域的普通临床医师能够轻易确定一个个 体是否是有必要进行动脉粥样硬化治疗的患者。

式(1)化合物的有效抗动脉粥样硬化量是在需要时有效抑制患 者动脉粥样硬化形成或生长的量。照此，动脉粥样硬化患者的成功 治疗被理解为包括有效地延缓、中断、阻止或停止动脉粥样硬化损 害或斑的形成或生长，但不必表示为动脉粥样硬化的全部消除。进 一步为本领域的普通技术人员所理解和领会的是，动脉粥样硬化的 成功治疗可以包括在防止动脉粥样硬化损害或斑生成方面的预防。

LDL脂质(例如LDL胆甾醇酯和磷脂的不饱和脂肪酸部分)的过 氧化已知促进了胆甾醇在巨噬细胞中的沉积，该巨噬细胞继而沉积 在血管壁上，并转化为泡沫细胞。需要抑制其LDL脂质过氧化的患 者的判断恰好是在本领域的普通技术人员的能力和知识范围内。例 如，如上所定义的有必要进行动脉粥样硬化治疗的个体也是有必要 抑制其LDL脂质过氧化的患者。式(1)化合物的有效抗氧化量是对抑 制患者血液中LDL脂质过氧化有效的量。

血胆甾醇过多是一种以血清胆甾醇水平或LDL胆甾醇水平为特 征的疾病状态，该水平在临床上显著高于被本领域的普通技术人员 认为是正常的水平。需要治疗其血胆甾醇过多的患者的判断恰好是 在本领域的普通技术人员的能力和知识范围内。例如，由临床实验 室化验所决定的、血清胆甾醇水平或LDL胆甾醇水平实质上和长期 高于被本领域的普通技术人员认为是正常的水平的个体即为有必要 进行血胆甾醇过多治疗的患者。借助于进一步的例子说明，面临形 成血胆甾醇过多危险的个体也可以是有必要进行血胆甾醇过多治疗 的患者。利用临床化验、体格检查和病历/家族史，本领域的普通临 床医师能够轻易确认患有血胆甾醇过多的患者和面临形成血胆甾醇 过多危险的患者，因此轻易确定一个个体是否是有必要进行血胆甾 醇过多治疗的患者。

术语“慢性炎性疾病”指的是以在没有可辨认的刺激物或微生物 病原体的存在下持续发炎为特征的疾病或病症。用式(1)化合物治疗 对其特别有用的炎性疾病包括：哮喘、慢性炎症、类风湿性关节炎、 自身免疫性糖尿病、移植物排斥和肿瘤血管生成。式(1)化合物的“治 疗有效量”是经对患者单剂或多剂给药后，对缓解与慢性炎性疾病 有关的症状有效的量。式(1)化合物的“有效的血管细胞粘着分子-1 和/或细胞间细胞粘着分子-1抑制量”是经对患者单剂或多剂给药 后，对缓解与血管细胞粘着分子-1和/或细胞间粘着分子-1介导的 病症有关的症状有效的量。

本文所用的慢性炎性疾病或血管细胞粘着分子-1介导的病症的 “症状缓解”指的是比不经过治疗的症状严重程度降低了，但不必 表示为疾病的全部消除或治愈。症状的缓解也应包括预防。

在确定式(1)化合物的治疗有效量或剂量、有效抗氧化量或剂 量、血浆胆甾醇降低量或剂量、有效抗动脉粥样硬化量或剂量、或 有效VCAM-1和/或ICAM-1抑制量时，有关诊断医师要考虑大量因 素，包括但不限于：哺乳动物的种类；它的大小、年龄和一般健康 状况；所涉及的具体疾病；疾病的程度或牵连性或严重性；个别患 者的反应；所给药的特定化合物；给药方式；所给药制剂的生物利 用度特征；所选择的剂量方案；同时使用的治疗药物；和其他相关 条件。

式(1)化合物的治疗有效量或剂量、有效抗氧化量、血浆胆甾醇 降低量、有效抗动脉粥样硬化量或有效VCAM-1和/或ICAM-1抑制量 一般从大约1毫克每千克体重每天(mg/kg/天)至大约5克每千克体 重每天(gm/kg/天)不等。约1mg/kg至约500mg/kg的每日剂量是优 选的。

本发明化合物是VCAM-1和/或ICAM-1表达的抑制剂。据信，本 发明化合物是通过抑制由细胞因子上调的VCAM-1和/或ICAM-1水平 来发挥其抑制活性的，从而预防炎性疾病或缓解症状，炎性疾病包 括哮喘、慢性炎症、类风湿性关节炎、自身免疫性糖尿病等等；动 脉粥样硬化和血胆甾醇过多。不过，在解释其在最终应用中的功效 时，本发明被理解为不受任何特定理论或建议机制的限制。

在对患者的治疗中，式(1)化合物可以以任意方式或模式给药， 给药方式使有效量的化合物是生物可利用的，包括口服和肠胃外途 径。例如，化合物可以口服、皮下、肌内、静脉内、透皮、鼻内、 直肠给药等等。一般优选口服给药。根据所治疗的疾病状态、疾病 的阶段和其他相关条件，药物制剂领域的技术人员能够轻易选择正 确的给药方式和模式。《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第18版，Mack出版公司(1990)。

式(1)化合物可以以药物组合物或药剂的方式给药，其制备方法 是将一种式(1)化合物与药学上可接受的载体或赋型剂组合，它们的 比例和性质是由所选择的给药途径和标准的药学惯例所决定的。

药物组合物或药剂是以药学领域熟知的方式制备的。载体或赋型 剂可以是一种固体、半固体或液体材料，它能起到有效成分的载体 或媒介的作用。适当的载体或赋型剂是本领域所熟知的。药物组合 物可以是适合于口服或肠胃外用途的，对患者可以以片剂、胶囊剂、 栓剂、溶液、悬液等等的方式给药。

药物组合物例如可以与一种惰性稀释剂或与一种可食用载体口 服给药。它们可以被包封在胶囊中或被压制成片。为了进行口服治 疗给药，式(1)化合物可以与赋型剂结合，并且可以以片剂、锭剂、 胶囊剂、酏剂、栓剂、糖浆剂、糯米纸囊剂、口香糖等等方式使用。 这些制剂应当含有至少4％的式(1)化合物作为有效成分，但是根据 特定方式可以变化，4％至约70％重量单位之间是适宜的。组合物中 存在的有效成分的量是使人们可以得到适于给药的单位剂量形式。

片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等等也可以含有一种或多种下列助剂： 粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋型剂，如淀粉或乳糖； 崩解剂，如海藻酸、Primogel、玉米淀粉等等；润滑剂，如硬脂酸 镁或Sterotex；助流剂，如胶体二氧化硅；和甜味剂，如可以加入 蔗糖或糖精，或矫味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙香料。若剂量单 位形式为胶囊，除了以上类型的物质以外，还可以含有一种液体载 体，如聚乙二醇或一种脂油。其他剂量单位形式可以含有其他改变 剂量形式的物理形状的不同物质，例如包衣料。因此，片剂或丸剂 可以用糖、虫胶或其他肠溶包衣剂进行包衣。除了有效成分以外， 糖浆剂可以含有蔗糖作为甜味剂，和某些防腐剂、染料及色素和矫 味剂。用于制备这些不同组合物的物质应当是药学纯的，并且在用 量上应当是无毒的。

为了进行肠胃外给药，可以将式(1)化合物加入到一种溶液或悬 液中。这些制剂应当含有至少0.1％的本发明化合物，但是其重量可 以在0.1与约50％之间变化。该组合物中存在的有效成分的量是使 人们可以得到适当的剂量。

根据式(1)化合物的溶解度和其他性质，溶液或悬液还可以含有 一种或多种下列助剂：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定 油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲 醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂， 如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于 调节毒性的试剂，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装在玻璃 或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

实施例24 所选择的酚性抗氧化剂在人主动脉平滑肌细胞或增生性人脐静脉内 皮细胞中对VCAM-1和ICAM-1细胞因子诱导的表达的百分抑制作用

将来自Clonetics(San Diego,CA)的增生性人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)或人主动脉平滑肌细胞(HASMC)置于96孔平皿中，每孔有 100μL培养基，每cm2有20000个细胞。在加入细胞因子或药物之前， 将培养物在生长培养基(EGM或SMGM2,Clonetics,San Diego,CA) 中保持两天。在分析粘着分子水平之前，加入含有或不含有化合物的 细胞因子，历时20至24小时。向培养物中加入500-1000单位/mL 的肿瘤坏死因子(Genzyme,Cambridge,MA)，以刺激ICAM-1表达。 向培养物中加入100-200 pg/mL的白介素-4(GIBCO-BRL, Gaithersburg,MD)，以刺激VCAM-1表达。(加入方法是将100μL连 续稀释在另一个96孔平皿上的细胞因子加化合物转移至含有细胞的 平皿中。在加入效应物之前不交换培养物上的培养基。)。除去培养 基，并在室温下用Hanks缓冲盐水溶液(HBSS)洗涤单层两次。向每孔 (1μg/mL，在HBSS加5％新生小牛血清，GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD) 中加入原发抗体(来自Upstate Biotechnology,Inc.,Lake Placid, NY的抗人VCAM-1或来自Immunotech,Inc.,Westbrook,ME的抗人 ICAM-1)，并在37℃下培养1小时。用HBSS洗涤孔两次，然后向每 孔加入100μL的的与辣根过氧化物酶共轭的山羊抗小鼠IgG(BioRad, Hercules,CA)在HBSS加5％新生小牛血清中的1/1000稀释液，并在 37℃下培养1小时。用HBSS洗涤孔三次，然后向每孔中加入100μL 的TMB底物(BioRad,Hercules,CA)。在显蓝色后加入50μL的1N H2SO4以终止反应。用平皿读数器测量450nm下的吸光度。

表1总结了使用人主动脉平滑肌细胞(HASMC)时所选择的本发明 化合物抑制VCAM-1和ICAM-1的能力。在这些实验中，细胞与白介 素-4共同培养以刺激VCAM-1表达，与肿瘤坏死因子-α共同培养以 刺激ICAM-1表达。

                         表1 对人主动脉平滑肌细胞(HASMC)中VCAM-1和ICAM-1的抑制作用     化合物编号     (MDL编号)       VCAM-1  (％抑制作用50μM)*       ICAM-1 (％抑制作用50μM)@     103,960     104,191     104,535      33.9±6      42.9±7      26.4±14       0±12       22±0      (10±5)

*三次实验平均值

@两次实验平均值，括号中的数字代表负值

表2总结了使用增生性人脐静脉内皮细胞(HUVEC)时本发明的不 同化合物选择性抑制VCAM-1或既抑制VCAM-1又抑制ICAM-1的能 力。在这些实验中，细胞与肿瘤坏死因子-α以及所示化合物共同培 养大约20至24小时后，测定细胞表面粘着分子的表达。

                       表2 对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中VCAM-1和/或ICAM-1的抑制作用     化合物编号     (MDL编号)     VCAM-1               ICAM-1 (％抑制作用50μM)*  (％抑制作用50μM)@     103,960     104,191     104,535      25.7                  9.5      34.3                  70.5      (2.5)                 11.5

*三次实验平均值，括号中的数字代表负值

@两次实验平均值

在其他预知涉及VCAM-1水平升高的炎症模型中，也可以测定这 些化合物的体内活性。这样一种呼吸疾病(如哮喘)的模型，是卵 白蛋白致敏模型。Kung,T.T．等《国际变态反应与免疫学文献》 (Int.Arch.Allergy Immunol.)105,83-90(1994)。该肺部炎症 模型是以IgE为媒介的，并涉及嗜酸粒细胞增多(哮喘患者即是如 此)。从实验动物得到的支气管小泡灌洗(BAL)液能够进行多种参数 的测定，包括可溶性粘着分子表达和白细胞蓄积。粘着分子表达能 用免疫组织化学的方法在实验动物组织内测定，尤其是肺。请求保 护的化合物的作用应当是抑制VCAM-1表达的上调，并抑制BAL液中 嗜酸细胞蓄积。可在大鼠辅助关节炎模型中对该抑制剂进行试验， 该模型曾显示出对抗ICAM-1单克隆抗体有应答。Iigo,Y．等《免疫 学杂志》147,4167-4171(1991)。在该模型中，粘着分子的表达将 在实验动物的肢部(关节)中测定。对自身免疫性糖尿病来说，在 NOD小鼠模型中可以试验化合物延缓疾病发作或预防疾病继承性转 移的能力。Heinke,E.W．等《糖尿病》42,1721-1730(1993)；Baron, J.L．等《临床研究杂志》93,1700-1708(1994)。而且，可以监测 组织(例如胰)中VCAM-1表达的水平，还可以监测实验动物糖尿病 的进展。通过监测心脏同种移植的存活率(移植给C3H/He受体的 Balb/c心脏。Isobe,M．等《免疫学杂志》153,5810-5818(1994))， 可以测定对移植排斥的治疗能力。抗VCAM-1和抗VLA-4单克隆抗体 的体内给药诱发对该小鼠模型心脏同种移植物和可溶性抗原的免疫 抑制作用。多种模型能够评价化合物对肿瘤转移和血管生成的作 用。它们可以包括B16(小鼠)和M24met(人)实验性黑素瘤转移 模型。Fidler,I.J．《癌症研究》(Cancer Res.)35,218-224(1975)； Meuller,B.M．等《癌症研究》51,2193-2198。通过化合物对多种 发展的肺转移瘤的作用以及对上述小鼠呼吸模型肺中VCAM-1表达 的作用，可以测定它们的活性。可用来对化合物进行试验的用于评 价抗血管生成化合物的模型涉及监测小鼠血管对皮下注射的血管生 成因子与基膜蛋白混合物的应答。Passaniti,A．等《实验室研究》 67,519-528(1992)。把补充到matrigel中的血管数量和凝胶的血 红蛋白含量记录为血管生成。如上所有实例所述，用免疫组织化学 方法可以测定粘着分子表达和白细胞蓄积。

实施例25 式(1)化合物对用胆甾醇饲喂的雌性新西兰白兔的血胆甾醇降低作 用和抗氧化作用

A．实验方案

如下方式进行五个独立实验。每个实验有一个对照组和1-5组 MDL化合物治疗组(每组N=5)。用含有或不含有0.4％MDL化合物 的富含0.2％胆甾醇的兔饲料(Purina #5322)饲喂雌性新西兰白兔 (Hazelton,～2.0-2.3kg)。将MDL化合物在100％乙醇中增溶。在 饲料上喷洒MDL混合物，并在化学通风橱中干燥过夜。在对照饲料 上喷洒乙醇。每天饲喂白兔100克饲料，饲喂7天(0.6％MDL 103, 491饲喂14天)；使动物可以随意地饮水。第7天，从白兔(禁食 过夜)耳缘静脉放血(～2mL)。用过量二氧化碳无痛致死白兔。记录 总体重和肝重的克数。记录饲料量，以克·天-1·兔-1表示。将新鲜 血清的等分试样用在血清临床化学、脂蛋白胆甾醇检测、硫巴比土 酸反应物(TBARS)和化合物与代谢物浓度测定中。将肝脏在-20℃下 冷冻(～5克等分试样)，用于晚些时候的化合物与代谢物浓度测定。

B．临床化学

使血液在室温下凝结30分钟。在5℃下，在带GH转子的Beckman GPKR离心机中以3000rpm离心10分钟后得到血清。使用Roche诊 断试剂，用COBAS MIRA自动分析仪(Roche Diagnostics)分析总胆 甾醇(CHOL，试剂盒#44334)和甘油三酯(TG，试剂盒#44120)。计算 胆甾醇和甘油三酯的mg/dL值。

C．TBARS测定

TBARS可定性表示样本中脂质的氧化作用。在该测定中，用CuSO4引发血清脂质的氧化作用，结果导致醛的生成，例如丙二醛(MDA)。 用硫巴比土酸培养后，在530-540nm下可以检测到醛的吸光度。低 于对照血清值的TBARS值表示了化合物抑制氧化作用的相对能力。 测量如下：将50μL血清与50μL的0．9％盐水和400μL的5mM CuSO4溶液混合，在37℃下培养5小时。加入1.0mL的20％三氯乙酸以终 止反应。然后加入1.0mL的0.67％硫巴比土酸的0.05N氢氧化钠溶 液，混合，并在90℃下将样本温育30分钟。简单地对样本进行离心， 使不溶物形成颗粒，再将上清液转移至96孔微量滴定板中。用 Biotek EL311型微量板读数器在540nm下测量吸光度。从0至10 纳摩尔的MDA(由丙二醛双(二甲基乙缩醛)制得)标准曲线计算所 产生的MDA纳摩尔数。比较来自受治疗兔子的血清样本与来自没有 接受MDL化合物的对照兔子的血清样本。

D．化合物与代谢物在血清和肝脏中浓度的HPLC定量测定

使用Waters 990 Powerline系统，用反相HPLC测定母体化合 物及其代谢物、即双酚和二苯酚合苯醌的血清浓度和肝浓度。使用 Polytron组织匀化器在5档设置下，用5.0mL PBS,pH7.4将肝脏 (1克)匀化20-30秒。如下萃取血清或肝脏匀浆化物：在使试管 涡旋的同时，向2.0mL二乙醚∶乙醇(3∶1)中加入100μL的血清或匀 浆化物。盖住样本试管，在5℃下在带GH 3.7转子的Beckman GPKR 离心机中以3500rpm离心10分钟。将上清液转移至干净的试管中， 在N2下干燥。用200μL的乙腈∶己烷∶0.1M乙酸铵(90∶6.5∶3.5体积 比)重新构成样本。向Waters Deltapak C18-300柱上注入100μL， 用83％乙腈∶17％水移动相洗脱，流速为1.5mL/min。记录在波长为 240、254和420nm下的吸光度。从经过回收率校正的已知量的真实 母体化合物计算化合物浓度。计算血清浓度的μg/mL值，计算肝脏 浓度的μg/g值。

E．脂蛋白亚级分胆甾醇水平的HPLC分离和定量测定

在连接Waters Powerline HPLC系统的Sepharose 6HR柱(1× 30cm,Pharmacia)上分离脂蛋白级分(极低密度脂蛋白VLDL，低密 度脂蛋白LDL和高密度脂蛋白HDL)。将血清(50μL)注入到柱上， 用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水洗脱，流速为0.5mL/min。以0.2mL/min 向后置柱洗脱液中加入胆甾醇试剂(Roche Diagnostics，试剂盒 #44334，用20mL水稀释，然后用20mL的0.9％盐水稀释)，在37 ℃下在编织PFTE Kratos反应盘管(Applied Biosystems)中恒温5 分钟。在500nm下测量吸光度。如下定量脂蛋白的亚级分： (总血清胆甾醇)×(每种亚级分曲线下％面积) 下表3和表4列出了该试验过程中单个实验的数据汇总。

                          表3

     式(1)化合物对胆甾醇饲喂的雌性新西兰白兔的

  血胆甾醇降低和抗氧化作用，相对于对照组的百分比 MDL# 饮食％ 食物 体重 lw/bw chol LDL HDL TRIG TBARS                        tot. 103,294 0.4    103％100％105％ 94％ 82％192％197％35％

N=5只兔子/组；禁食过夜

兔子饲喂7天

饮食％=(MDL化合物重量/食物重量)×(100)

表3中数据如下进行规一化：

％对照=(平均，治疗组/平均，对照组)×(100)

食物=每只兔子每天吃掉的克数

体重=重量克数

LW/BW=(肝重/体重克数)

CHOL=总胆甾醇mg/dL

LDL=低密度脂蛋白胆甾醇mg/dL

HDL=高密度脂蛋白胆甾醇mg/dL

TRIG=甘油三酯mg/dL

TBARS=硫巴比土酸反应物，以纳摩尔MDA表示

                     表4

      兔血清和肝脏中的药物和代谢物浓度  MDL# 饮食％      血清               肝脏       母体  Bis    Quin  母体  Bis  Quin  103,294 0.4   19.8  0      0      77   0    0

N=5只兔子/组；禁食过夜

兔子饲喂7天

饮食％=(MDL化合物重量/食物重量)×(100)

表4中数据以平均值(N=5)给出，没有对对照值进行过规一化。

血清母体=母体化合物浓度，以μg/mL血清表示

血清Bis=双酚浓度，以μg/mL血清表示

血清Quin=二苯酚合苯醌浓度，以μg/g血清表示

肝脏母体=母体化合物浓度，以μg/g肝脏表示

肝脏Bis=双酚浓度，以μg/g肝脏表示

肝脏Quin=二苯酚合苯醌浓度，以μg/g肝脏表示

实施例26 体内筛选法测量式(1)化合物在雄性Sprague-Dawley 大鼠中的抗氧化活性和生物利用度

A．实验方案

典型的实验由4-6组大鼠组成(每组N=5)，其中1组为对照， 不接受MDL化合物，其他组用0.3％MDL化合物处理。一些化合物的 剂量保持在0.3％，另一些在较低的0.1％剂量下进行评价。笼养雄性 Sprague-Dawley大鼠，50-100克(Harlan Laboratories, Indianapolis,IN)，分5组，使动物可以随意地饮水，用含有或不 含有MDL化合物的Purina Rodent饲料(#5002)作为饮食混合物饲喂 4天。将1.2克的一种MDL化合物与400克Purina rodent饲料(#5002) 混合，制成饮食混合物(0.3％)。使用研钵和研棒，将MDL化合物与 大约50克食物混合。将其加入到其余食物中，在旋转混合器中混合 3小时。在第5天早晨，用二氧化碳麻醉没有禁食的大鼠，用心脏穿 刺法收集血液。用颈脱位法处死大鼠。记录体重和肝重的克数。记 录食物消耗量，以克·天-1·大鼠-1表示。记录死亡的只数作为死亡 率。将新鲜血清等分试样用在临床化学、硫巴比土酸反应物(TBARS) 和共轭二烯测量中。将血清的等分试样(～0.5mL)和全肝在-20℃下 冷冻，用于晚些时候的化合物与代谢物浓度测定。

B．临床化学

使血液在室温下凝结30分钟。在4℃下，在带JS-4.2转子的 Beckman J-6M/E离心机中以3000rpm离心10分钟后得到血清。使 用Roche诊断试剂，用COBAS MIRA S自动分析仪(Roche Diagnostics) 分析新鲜血清，用于下列临床化学测量：碱性磷酸酶(ALP，试剂盒 #44553)、丙氨酸转氨酶(ALT，试剂盒#42375)、天冬氨酸氨基转移 酶(AST，试剂盒#42381)、总胆甾醇(CHOL，试剂盒#44334)、甘油三 酯(TG，试剂盒#44120)和葡萄糖(GLU，试剂盒#44558)。计算ALP、 ALT和AST的单位/L值。计算胆甾醇、甘油三酯和葡萄糖的mg/dL 值。

C．血清和肝脏中化合物和代谢物浓度的HPLC定量测定

使用Waters 990 Powerline系统的反相HPLC测定母体化合物 及其代谢物、即双酚和二苯酚合苯醌的血清浓度和肝浓度。使用 Polytron组织匀化器在5档设置下，用5.0mL PBS,pH7.4将肝脏 (1克样本)匀化20-30秒。如下萃取血清或肝脏匀浆化物：在使 试管涡旋的同时，向2.0mL二乙醚∶乙醇(3∶1)中加入100μL的血清 或匀浆化物。盖住样本试管，在5℃下在带GH 3.7转子的Beckman GPKR离心机中以3500rpm离心10分钟。将上清液转移至干净的试 管中，在N2下干燥。用200μL的乙腈∶己烷∶0.1M乙酸铵(90∶6.5∶3.5 体积比)重新构成样本。然后向Waters Deltapak C18-300柱上注 入100μL，用83％乙腈∶17％水移动相洗脱，流速为1.5mL/min。记录 在波长为240、254和420nm下的吸光度。从经过回收率校正的已知 量的真实母体化合物计算化合物浓度。计算浓度，μg/mL。计算血 清浓度的μg/mL值，计算肝脏浓度的μg/g值。

D．硫巴比土酸反应物(TBARS)测定

在该测定中，用CuSO4引发血清脂质的氧化作用，结果导致醛的 生成，例如丙二醛(MDA)。用硫巴比土酸培养后，在530-540nm下 可以检测到醛的吸光度。如前面的实施例所述，低于对照血清值的 TBARS值表示了受试化合物抑制样本中脂质氧化作用的相对能力。 测量TBARS如下：将100μL血清与400μL的5mmol CuSO4溶液混合， 在37℃下培养3小时。加入1.0mL的20％三氯乙酸以终止反应。然 后加入1.0mL的0.67％硫巴比土酸的0.05N氢氧化钠溶液，混合， 并在90℃下将样本恒温30分钟。简单地对样本进行离心，使不溶物 形成颗粒，再将上清液转移至96孔微量滴定板中。用Biotek EL311 型微量板读数器在540nm下测量吸光度。从0至10纳摩尔的MDA(由 丙二醛双(二甲基乙缩醛)制得)标准曲线计算所产生的MDA纳摩尔 数。比较来自受治疗大鼠的血清样本与来自没有接受MDL化合物的 对照大鼠的血清样本。

E．共轭二烯测定

共轭二烯迟滞期是脂质氧化的另一个指标。脂质与Cu++接触形成 共轭二烯，吸收230至235nm范围的紫外光。二烯形成的迟滞期表 示了脂质氧化的量。长于对照样本的迟滞期表示对氧化的抑制作 用。在30℃下，使用Varian DMS200分光光度计(装有一个恒定温 度的5只吸收池样品转换器)测定共轭二烯迟滞期。向含有3.0mL 磷酸盐缓冲盐水，pH7.5的吸收池中加入二十(20)μL汇集的血清， 并混合。测量所有吸收池的吸光度，利用最小吸收样本设置仪器的 基线为零。下一步，加入100μL的1mmol CuSO4并立即混合。每隔2 分钟记录每只吸收池的吸光度，历时840分钟。截取数据，并转移 到微软EXCEL电子表格(spreadsheet)中，使曲线平滑，并得到 微分值。用数学方法测定迟滞期，以分钟表示。汇集血清样本(N=5)； 所列数据为2次测定的平均值。比较经过处理的大鼠血清样本与没 有接受MDL化合物的对照大鼠血清样本。

下表5、表6和表7给出了来自该试验过程的单个实验的数据汇 总。表5为雄性Sprague-Dawley大鼠的血清化学测量结果，表6为 动物参数，表7提供了药物或代谢物在血清和肝脏中的浓度。

                     表5

      式(1)化合物对雄性Sprague-Dawley大鼠的

       抗氧化作用，以相对于对照的百分比表示     MDL No. 饮食％   ALP   AST   ALT   CHOL   GLUC   TRIG   TBARS    共轭                                                          二烯                                                         (min.)     103,294     103,649     103,714     103,960     104,102     104,191     104,487     104.535     105,411     107,059  0.3    124％  88％  132％ 102％  103％  56％   18％     ND*  0.3    74％   82％  119％ 89％   101％  143％  29％     375  0.3    111％  104％ 120％ 90％   95％   122％  21％     ND  0.3    125％  102％ 117％ 113％  110％  80％   24％     363  0.3    101％  82％  114％ 100％  98％   127％  71％     229  0.3    81％   146％ 149％ 109％  106％  112％  20％     708  0.3    137％  124％ 129％ 127％  92％   108％  87％     ND  0.3    151％  94％  108％ 103％  112％  60％   11％     ND  0.3    76％   87％  122％ 105％  96％   100％  29％     400  0.3    118％  140％ 116％ 89％   96％   35％   78％     201

*ND=未检测

N=5只大鼠/组

饮食％=(MDL化合物重量/食物重量)×(100)

共轭二烯=共轭二烯迟滞期的分钟数(2次汇集样本测定的平均 值，N=5)

表5中的数据除了共轭二烯和饮食百分比以外，均作如下规一化 处理：

％对照=(平均，治疗组/平均，对照组)×(100)

ALP=碱性磷酸酶，U/mL

AST=天冬氨酸氨基转移酶，U/mL

ALT=丙氨酸氨基转移酶，U/mL

CHOL=总胆甾醇，mg/dL

TG=甘油三酯，mg/dL

GLU=葡萄糖，mg/dL

TBARS=硫巴比土酸反应物，以MDA纳摩尔数表示。

                      表6

    动物参数，以相对于对照的百分比表示  MDL No.    饮食％  食物    体重    lw/bw  死亡率  103,294  103,649  103,714  103,960  104,102  104,191  104,487  104,535  105,411  107,059     0.3    108％    101％  129％  0％     0.3    95％     94％   111％  0％     0.3    102％    103％  121％  0％     0.3    105％    100％  130％  0％     0.3    92％     97％   121％  0％     0.3    76％     92％   126％  0％     0.3    90％     95％   150％  0％     0.3    95％     102％  119％  0％     0.3    95％     101％  114％  0％     0.3    95％     95％   107％  0％

N=5只大鼠/组

饮食％=(MDL化合物重量/食物重量)×(100)

表6中的数据已按表5中所列公式进行过规一化处理。

食物=每只大鼠每天吃掉的克数

体重=重量克数

LW/BW=(肝重/体重克数)

死亡率=每组死亡数

                    表7

   大鼠血清和肝脏中的药物和代谢物浓度     MDL No.    饮食％         血清                   肝脏            母体   Bis    Ouin    母体    Bis    Ouin    103,294    103,649    103,714    103,960    104,102    104,191    104,487    104,535    105,411    107,059     0.3    21.7    0      0      64.6     0      0     0.3    1.4     0      0      0        0      0     0.3    2.7     0      0      0        0      0     0.3    8.7     0      0      47.3     39.4   0     0.3    32.8    0      0      481      0      0     0.3    6.9     0      0      16.1     0      0     0.3    4.1     0      0      3.8      11.5   0     0.3    16.3    0      0      60.3     0      0     0.3    1.1     0      0      0        0      0     0.3    0       0      0      0        0      0

表7中的数据以平均值(N=5)给出，没有对对照值进行过规一化 处理。

血清母体=母体化合物浓度，以μg/mL清表示

血清Bis=双酚浓度，以μg/mL血清表示

血清Quin=二苯酚合苯醌浓度，以μg/g血清表示

肝脏母体=母体化合物浓度，以μg/g肝脏表示

肝脏Bis=双酚浓度，以μg/g肝脏表示

肝脏Quin=二苯酚合苯醌浓度，以μg/g肝脏表示

实施例27 式(1)化合物对胆甾醇饲喂的 雌性新西兰白兔的抗动脉粥样硬化作用

A．实验方案

进行四个独立实验。每个实验有一个对照组和1-5组MDL化合 物治疗组(每组N=5)。用含有或不含有0.4％MDL化合物的富含 1％胆甾醇的兔饲料(Purina#5322)饲喂雌性新西兰白兔 (Hazelton,～2.0-2.3kg)。将MDL化合物在100％乙醇中增溶，在 饲料上喷洒，并在化学通风橱中干燥过夜。或者，可以用Purina将 MDL化合物加入到兔食中。在对照饲料上喷洒乙醇。每天饲喂白兔 100克饲料，饲喂70天，使动物可以随意地饮水。周期性从白兔(禁 食过夜)耳缘静脉放血(～2mL)，以监测血清胆甾醇水平。在第70 天用过量二氧化碳无痛致死白兔。记录总体重和肝重的克数。记录 食物消耗量，以克·天-1表示。将新鲜血清的等分试样用在血清临 床化学、脂蛋白胆甾醇检测、硫巴比土酸反应物(TBARS)和化合物与 代谢物浓度测定中。将肝脏在-20℃下冷冻(～5克等分试样)，用 于晚些时候的化合物与代谢物浓度测定。

每只兔子处死后立即解剖主动脉。体外脂肪组织清创术后切除从 上行弓至髂骨分叉之间的主动脉。将主动脉贮存在4℃的磷酸盐缓冲 盐水，pH7.4中过夜，直至最终清创术完成。纵向切开主动脉，用 苏丹Ⅳ染色。染色后，用别针压平主动脉，截取电子图象后定量计 算嗜苏丹损害面积。

B．临床化学

使血液在室温下凝结30分钟。在5℃下，在带GH 3.7转子的 Beckman GPKR离心机中以3000rpm离心10分钟后得到血清。使用 Roche诊断试剂，用COBA MIRA自动分析仪(Roche Diagnostics) 分析总胆甾醇(CHOL，试剂盒#44334)和甘油三酯(TG，试剂盒 #44120)。计算胆甾醇和甘油三酯的mg/dL值。

C．TBARS测定

用CuSO4引发血清脂质的氧化作用，结果导致醛的生成，例如丙 二醛(MDA)。用硫巴比土酸培养后，在530-540nm下检测醛的吸光 度。如下测量TBARS：将50μL血清与50μL的0.9％盐水和400μL的 5mmol CuSO4溶液混合，在37℃下培养5小时。加入1.0mL的20％三 氯乙酸以终止反应。加入1.0mL的0.67％硫代巴比土酸的0.05N氢 氧化钠溶液，混合，并在90℃下将样本恒温30分钟。简单地对样本 进行离心，使不溶物形成颗粒，再将上清液转移至96孔微量滴定板 中。用Biotek EL311型微量板读数器在540nm下测量吸光度。从0 至10纳摩尔的MDA(由丙二醛双(二甲基乙缩醛)制得)标准曲线计 算所产生的MDA纳摩尔数。比较来自受治疗兔子的血清样本与来自 没有接受MDL化合物的对照兔子的血清样本。

D．化合物与代谢物在血清和肝脏中浓度的HPLC定量测定

使用Waters 990 Powerline系统通过反相HPLC测定母体化合 物及其代谢物、即双酚和二苯酚合苯醌的血清浓度和肝浓度。使用 Polytron组织匀化器在5档设置下，用5.0mL PBS,pH7.4将肝脏 (1克)匀化20-30秒。如下萃取血清或肝脏匀浆化物：在使试管 涡旋的同时，向2.0mL二乙醚∶乙醇(3∶1)中加入100μL的血清或匀 浆化物。盖住样本试管，在5℃下在带GH 3.7转子的Beckman GPKR 离心机中以3500rpm离心10分钟。将上清液转移至干净的试管中， 在N2下干燥。用200μL的乙腈∶己烷∶0.1M乙酸铵(90∶6.5∶3.5体积 比)重新构成样本。然后向Waters Deltapak C18-300柱上注入 100μL，用83％乙腈∶17％水移动相洗脱，流速为1.5mL/min。记录在 波长为240、254和420nm下的吸光度。从经过回收率校正的已知量 的真实母体化合物计算化合物浓度。计算血清浓度的μg/mL值，计 算肝脏浓度的μg/g值。

E．脂蛋白亚级分胆甾醇水平的HPLC分离和定量测定

在连接Waters Powerline HPLC系统的Sepharose 6HR柱(1× 30cm,Pharmacia)上分离VLDL、LDL和HDL的脂蛋白级分。将50μL 血清注入到柱上，用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水洗脱，流速为 0.5mL/min。以0.2mL/min向后置柱洗脱液中加入胆甾醇试剂(Roche Diagnostics，试剂盒#44334，用20mL水稀释，然后用20mL的0.9％ 盐水稀释)，在37℃下在编织PFTE Kratos反应盘管(Applied Biosystems)中恒温5分钟。在500nm下测量吸光度。如下定量脂蛋 白的亚级分：

(总血清胆甾醇)×(每种亚级分曲线下％面积)

另外，式(1)化合物可以用作化学抗氧化剂添加剂，加入到在正 常情况下会氧化变质的有机材料中，例如橡胶、塑料、油脂、石油 产品等等。一般来说，将防腐量的式(1)化合物与易遭受氧化反应的 材料混合，该防腐量的式(1)化合物浓度足以抑制被保护材料的氧 化变质。式(1)化合物的防腐量一般从约0.01重量％至约1.0重量％ 不等。