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用于哺乳动物细胞培养的给料添加剂及使用方法

阅读：604发布：2021-02-24

IPRDB可以提供用于哺乳动物细胞培养的给料添加剂及使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了用于培养用于生产蛋白质的哺乳动物的改进的给料添加剂。改进的添加剂不含动物来源的成分和蛋白质水解产物。本发明还提供了在治疗性蛋白例如抗体的生产中使用添加剂的方法。在一些实施方案中，抗体是抗人IL-23p19抗体。，下面是用于哺乳动物细胞培养的给料添加剂及使用方法专利的具体信息内容。

权利要求

1. 一种细胞给料添加剂浓缩物，其包含表3的成分1至47以及a) 亚硒酸钠；或

b) 维生素E。

2. 权利要求1的添加剂，其包含亚硒酸钠和维生素E。

3. 权利要求1的添加剂，其中所述亚硒酸钠以约0.3 mg/L存在。

4. 权利要求1的添加剂，其中所述维生素E以约30.2 mg/L存在。

5. 一种生产蛋白质的方法，其包括在补充有权利要求1的添加剂的生长培养基中培养细胞。

6. 一种生产蛋白质的方法，其包括：a) 在培养物中使表达所述蛋白质的哺乳动物细胞生长；

b) 用权利要求1的添加剂补充所述培养物；和c) 从所述培养物回收蛋白质。

7. 权利要求6的方法，其还包括将培养物的温度从37℃转换至34℃。

8. 权利要求7的方法，其中在接种后第3、第4或第5天进行温度的转换。

9. 权利要求6的方法，其中另外重复补充步骤(b)两次或更多次。

10. 权利要求10的方法，其中在接种后第3、5和10天进行补充步骤。

11. 权利要求5或6的方法，其中所述细胞是CHO细胞。

12. 权利要求5或6的方法，其中所述蛋白质是抗体或其抗原结合片段。

13. 权利要求12的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG恒定结构域。

14. 权利要求12的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人IL-23p19。

15. 权利要求14的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含国际专利申请公开号WO 2008/103432中公开的抗体hu13B8b的至少一个重链CDR和至少一个轻链CDR。

16. 一种生产蛋白质的方法，其包括：a) 在培养物中使表达所述蛋白质的哺乳动物细胞生长；

b) 用亚硒酸钠或维生素E补充所述培养物；和c) 从细胞培养物获得所述蛋白质。

17. 权利要求16的方法，其中用亚硒酸钠和维生素E补充所述培养物。

18. 权利要求16的方法，其中向所述培养物中加入亚硒酸钠以产生约0.02 mg/L的终浓度。

19. 权利要求16的方法，其中向所述培养物中加入维生素E以产生约2 mg/L的终浓度。

20. 权利要求16的方法，其中向所述培养物中加入亚硒酸钠以产生约0.02 mg/L的终浓度和向培养物中加入维生素E以产生约2 mg/L的终浓度。

说明书全文

用于哺乳动物细胞培养的给料添加剂及使用方法

发明领域

[0001] 本发明一般涉及用于培养用于生产重组蛋白例如抗体的细胞的培养基添加剂（media supplement）。

[0002] 发明背景中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物通常被用于生产用作治疗剂的蛋白质例如治疗性
抗体。用于此类细胞培养物的生长培养基历来包括动物来源的添加剂，但此类添加剂近
年来已与传播性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies）(TSE)例
如牛海绵样脑病(BSE, 疯牛病)的出现相关，所述疾病与人的变异克雅氏症(variant
Creutzfeldt-Jakob disease) (vCJD) 相关。参见，例如，Cleland等人 (2007) J.
Microbiol. Meth. 69:345。鉴于由此产生的关于此类污染的担忧，优选使用不包含动物来源的成分的生产培养基进行药物试剂的制备。

[0003] 蛋白质水解产物例如大豆水解产物也已在细胞培养基中被用作添加剂以增加生产率。然而，此类水解产物的质量在不同批次间可变化，从而影响生产的产品的数量和质量。

[0004] 因此，存在对用于在培养的CHO细胞中生产治疗性蛋白质的改进的方法的需要，所述方法不涉及添加可引入麻烦的污染物的动物来源成分。优选地，此类方法还可支持从培养的CHO细胞高水平表达治疗性多肽。

[0005] 发明概述本发明通过提供基于改良的20X DMEM/F12的给料添加剂（feed supplement）浓缩物
（在本文中称为“SP给料”，其不含动物成分和蛋白质裂解物）和使用该添加剂用于培养产生治疗性多肽的CHO细胞的方法来满足这些需要和更多需要。在一个实施方案中，治疗性多肽是抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，治疗性多肽是IgG抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，治疗性抗体是特异性结合人IL-23p19的嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。

[0006] 在一个实施方案中，本发明的生产给料添加剂包括维生素E和/或亚硒酸钠(Na2SeO4)。在另一个实施方案中，维生素E以约30.2 mg/L存在于添加剂浓缩物中。在另一个实施方案中，亚硒酸钠以约0.3 mg/L存在于添加剂浓缩物中。在另外的实施方案中，生产给料添加剂浓缩物包含表3中所列的成分。

[0007] 在另一个方面，本发明提供了使用本发明的补充剂生产治疗性蛋白质的方法。在一个实施方案中，所述方法包括顺流进料（forward-feeding）原理，其中向细胞培养物提供的营养物的量基于细胞的生长速率和营养物消耗。在不同实施方案中，在生产过程中在超过一个场合，例如在一系列两次或更多次批式进料（bolus feeding）中，例如在第3、5和10天，向细胞培养基中加入本发明的给料添加剂。在另一个实施方案中，在早期指数生长期、晚期指数生长期和静止期中，加入本发明的添加剂。在不同的实施方案中，将培养物补充1、2、3、4、5或更多次。在还其他实施方案中，可每天加入或在连续或半连续的基础上加入添加剂以确保随时间推移成分的浓度稳定。在不同实施方案中，本发明包括在适当的培养期后从培养物回收蛋白质，该回收可来自培养基（上清液）、细胞（例如，通过裂解）或两者。

[0008] 在一个实施方案中, 分开地向培养物中加入本发明的生产给料添加剂的一个或多个成分，例如1、2、3或更多个成分可与其余成分的混合物分开地加入。在一个实施方案中，酪氨酸和/或半胱氨酸与其他给料成分的混合物分开地加入。

[0009] 在另一个方面，本发明提供了在培养物中补充哺乳动物细胞用于生产蛋白质的方法，所述方法包括在生产运行过程中向培养基中加入维生素E和/或亚硒酸钠至少一次。在不同的实施方案中，给培养物补充维生素E至约2 mg/L、4 mg/L或6 mg/L的终浓度。在不同的其他实施方案中，给培养物补充亚硒酸钠至约0.02 mg/L、0.04 mg/L或0.06 mg/L的终浓度。

[0010] 在一些实施方案中，本发明的方法和给料添加剂以至少与使用补充有植物水解产物例如大豆水解产物的生长培养基获得的一样高的水平（效价）支持治疗性蛋白质的生产。在不同实施方案中，本发明的给料和方法以为基础给料（仅有葡萄糖和谷氨酰胺）的约1.2、
1.4、1.6、1.8或2.0倍或更高效价支持治疗性单克隆抗体的生产。

[0011] 在一些实施方案中，本发明的方法和培养基支持治疗性蛋白质的生产，所述蛋白质至少与使用含大豆水解产物的给料培养基获得的一样纯。在一些实施方案中，在利用蛋白质A亲和层析纯化抗体后评估纯度。可以例如通过反相HPLC或大小排阻层析(HP-SEC)测定纯度。

[0012] 在一个实施方案中，在生产过程中例如在生产的第3、4或5天将培养的温度从37℃转换至34℃。

[0013] 在一个实施方案中，将本发明的添加剂制备为20X的浓缩物并且在生产运行中将其加入至1.33X、2.66X和/或4X的终浓度。在其他实施方案中，制备添加剂，并且将其以2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、11X、12X、12X、13X、14X、15X、16X、17X、18X、19X或更高倍数的浓缩物使用。在还其他实施方案中，制备补充剂并且将其以21X、22X、23X、24X、25X、26X、
27X、28X、29X、30X或更高倍数的浓缩物使用。

[0014] 附图简述图1A显示作为在生产过程中如何（以及是否）向培养物进行给料的函数的使用商业基
础培养基培养的3个抗体生产细胞系的相对效价的增加。由所述细胞系产生的抗体在本文中称为抗体A(空心柱)、B(阴影线柱)和C(实心柱)。将所有细胞培养在具有指定的添
®
加剂的商业基础培养基中。所使用的基础培养基是Sigma C5467 EX-CELL ACF CHO培养
基（其不含动物成分，具有HEPES，不具有L-谷氨酰胺，为过滤灭菌的液体），细胞培养物测试的，具有金黄三羧酸(ATA)(针对产生抗体A和C的细胞)或不具有ATA(针对产生抗体B
和将在下文中进行论述的抗体D、E和F的细胞)。在37℃下培养图1A和1B中的所有培养
物。用大豆水解产物、商购可得的给料培养基浓缩物或SP给料补充培养物。商购可得的给料培养基是Sigma C1615 CHO给料生物反应器添加剂(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA)。利用反相HPLC测定抗体效价。

[0015] 图1B显示与图1A中显示的数据相似的数据，除了提供的数据是补充大豆水解物和SP给料的细胞以外。

[0016] 图2A - 2D显示不同抗体的相对效价的增加。图2A和2B显示在2L布朗生物反应器(图2A)和摇瓶(图2B)中，作为是用大豆水解物或用SP给料补充培养物的函数的抗
体D的相对效价的增加。图2C显示作为使用基础给料、用大豆水解物补充的或用SP给料
补充的基础给料培养培养物的函数的摇瓶中表达抗体E的两个克隆的相对效价的增加。图
2D显示作为用基础给料、用大豆水解物补充的或用SP给料补充的基础给料培基培养培养
物的函数的摇瓶中表达抗体F的10个不同选择的克隆的相对效价的增加。很显然，将相对效价针对补充有大豆水解产物的培养物的效价标准化。

[0017] 图3显示作为是用大豆水解产物、SP给料或两者补充培养物的函数的在37℃ (斑点状柱)或34℃(空心柱)下培养的抗体生产细胞系的相对效价。用于本实验的细胞系产生抗体A。在37℃下生长的培养物在所有条件下具有更低的效价。将数据针对用大豆水解产物补充的并且在37℃下培养的培养物标准化。

[0018] 图4显示单克隆抗体生产细胞系的细胞凋亡的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)流式细胞术分析。用于本实验的细胞系产生抗体D。用大豆水解产物或SP给料补充培养物。在第0、6、13和19天采集样品，用膜联蛋白V (x-轴)和碘化丙啶(y-轴)染色，利用流式细
胞术进行分析。

[0019] 图5显示补充有大豆水解产物或SP给料的单克隆抗体生产细胞系（产生抗体D）的流式细胞术分析。在第0、6、13或19天，用多聚甲醛固定细胞，透化细胞，然后用异硫氰酸荧光素(FITC)-抗-人Fc抗体染色。Lecoeur等人(1997) J. Immunol. Methods 209:
111。基于从前向散射/侧向散射(FSC/SSC)概况（profile）得到的细胞大小和和粒度设置活力门控（Viable gate）。直方图在FITC强度的范围上标绘了表达指定的FITC强度的细
4
胞的数目，从而反映了包含抗体的细胞的数目。x-轴是从0至10 个细胞的对数标度，y-轴是0至200的计数的线性标度。

[0020] 详述本文中引用的全部参考资料以引用的方式全部并入本文中，该引用的程度就如同已特
定地及个别地将各个公开案、数据库条目（database entry）(例如GenBank序列或GeneID条目)、专利申请或专利之整体公开内容以引用的方式并入一般。本文中参考的核酸和蛋白质序列的GenBank登录号是指至本申请的提交日期为止的数据库的内容。虽然可随后修饰此类数据库条目，但GenBank维持根据日期的所有以前版本的序列的公开记录，使得此类数据条目成为对特定序列的明确参考。

[0021] 此外，通过引用并入任何专利或公开的专利申请意图为并入该专利或公开的专利申请的序列表中的序列。例如，通过引用并入公开特异性结合IL-23p19的抗体的专利或公开的专利申请意图为并入其中所有序列，包括以蛋白质和核酸形式存在的所有CDR、CDR变体、可变结构域以及轻链和重链。

[0022] 由申请者根据37 C.F.R. §1.57(b)(1) 做出的通过引用而并入的该声明意图为涉及各个和每一个单个的公开、数据库条目（例如GenBank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，遵照37 C.F.R. §1.57(b)(2)明确地确定其每一个，即使这样的引用不与指定的通过引用而并入的专门声明直接相邻。将通过引用而并入的专门声明（如果有的话）包括在本说明书中不以任何方式削弱通过引用而并入的该一般声明。本文中参考的引用无意作为所述参考资料是有关的现有技术的承认，其也不构成关于这些公开或文献的内容或日期的任何承认。

[0023] I. 定义如本文（包括所附权利要求）中所使用的，除非上下文明确的指出，否则单词的单数形
式例如“一”(“a”和“an”)和“其”(“the”) 包括其相应的复数指代。

[0024] 如本文中所使用的，"DMEM/F12" 是指达尔伯克氏改进伊格尔培养基(DMEM)与®
Ham's F12基础培养基的1:1混合物。该培养基例如作为Sigma EX-CELL ACF CHO 培养基
(目录号C5467)是商购可得的。本发明的给料添加剂（SP给料）基于20X DMEM/F12的改进形式，该改进形式具有减少的无机盐（以在生产过程中减少渗量（osmolarity）建立)并且不具有HEPES或酚红。20X DMEM/F12的该改进形式包含表3的成分1至46。除非另外指
出，否则编号的“成分”在本文中是指表3中所列的成分。SP给料包含表3的全部49个成
分，即具有加入至15g/L的谷氨酰胺并且还补充有亚硒酸钠 (0.3 mg/L)和维生素E (30.2 mg/L)的改进20X DMEM/F12，如所指示的。

[0025] 除非另外指出，否则按其在表3中的编号提及的成分以表3中所列的浓度使用。

[0026] 出于实用原因，通常只在即将进料之前向SP给料混合物中加入谷氨酰胺（成分47）以避免谷氨酰胺的脱酰胺作用。此外，不提前将酪氨酸(成分27)和半胱氨酸(成分
13)与其他成分混合，而是相反在进料时将其分开地加入培养物。不希望受理论束缚，酪氨酸和半胱氨酸的溶解度排除了在进料前将它们加入SP给料浓缩物，因为它们倾向于随时
间流逝从溶液沉降出来。例如，对于包括3次一次性进料的生产运行，在进料的当天通过加入6.7%的培养物体积（在生产运行期间加入的总共20%的给料的1/3）向培养物中加入在
SP给料成分1至47的预混合溶液。向培养物中加入适当量的亚硒酸钠，以及向培养物中加入适当量的维生素E，以便培养物中全部49个成分的终浓度大体上与当全部49个成分以
包含表3中提供的量的预混合物溶液（浓缩物）加入时它们可具有的浓度相同。这样的计算完全在制造治疗性蛋白质的技术人员的能力之内。虽然分开地向培养物中加入成分48、成分49和成分1至17的混合物，但可以以任意次序加入它们。因此表3中提供的制剂可在
这样的意义上（即可向培养物中加入给料浓缩物的成分以达到与当制备单个溶液（无论是出于实用原因还是出于方便而分开地加入有限的组分数目）时获得的相同的最终结果）被视为“实际”制剂。

[0027] 在不同的实施方案中，本发明的添加剂包括由存在于表3中的成分的比率（无论其配制时的浓度）确定的组合物。因此，本发明不限定于任意指定的浓度。本发明包括表3中提供的20X浓缩物形式，但也可包括任意其他浓度，例如低于1X、1X、2X、3X、4X、5X、6X.
7X、8X、9X、10X、11X、12X、12X、13X、14X、15X、16X、17X、18X、19X、20X、21X、22X、23X、24X、25X、
26X、27X、28X、29X、30X或高于30X以及还包括任意非整数倍的浓度。意欲加入添加剂以产生约（但不必正好是）4X的终浓度。

[0028] 本文中报导的“X”浓度是任意的，并且只基于本发明的给料添加剂来源于“20X”DMEM/F12培养基的事实。因此，“X”浓度不反映任意具体的期望的工作浓度或终浓度。培养基中4X的终浓度例如可以是完全适合的。该用法可以与典型用法不同，在典型用法中这通常意指"1X"代表反应混合物或培养基的某种期望的“终”浓度。

[0029] 如本文中所使用的，术语“抗体”可以指展示期望的生物活性的任意抗体形式。因此，其以最广泛的意义使用并且明确地涵盖单克隆抗体（包括全长单克隆抗体）、多克隆抗体、多特异性抗体（例如，双特异性抗体）、嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体等，只要它们展示期望的生物活性。

[0030] 如本文中所使用的，当提及抗体时，术语“其结合片段”或其抗原结合片段包括仍然大体上保持结合其靶的能力的抗体的片段或衍生物。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体（diabody）；线性抗体；单链抗体分子例如sc-Fv和从抗体片段形成的多特异性抗体。一般地，结合片段或衍生物保持至少10%的其对于其靶的亲和力，例如解离平衡结合常数（dissociation equilibrium binding constant） (Kd)的10倍以内的变化。优选，结合片段或衍生物保持至少25%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100% (或更多)的其结合亲和力，虽然具有足以产生期望的生物效应的任意结合片段将是有用的。当明确提出时，也期望结合片段可包括具有不显著改变其生物活性的保守氨基酸置换的序列变体。

[0031] "IL-23拮抗剂"是以任意方式抑制IL-23的活性的分子。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段是例如通过结合IL-23的亚基或其受体经由IL-23受体抑制
IL-23的信号转导。在其他实施方案中，IL-23拮抗剂是小分子或多核苷酸，例如反义核酸或siRNA。

[0032] "白细胞介素-23(或"IL-23")意指由两个多肽亚基p19和p40组成的蛋白质。p19亚基（也称为IL-23p19, IL23A)的序列以NCBI蛋白质序列数据库登录号NP _057668、AAH67511、AAH66267、AAH66268、AAH66269、AAH667512、AAH67513或此类序列的天然存在的变体的任一个提供。p40亚基(也称为IL-12p40、IL12B)的序列是如NCBI 蛋白质序列
数据库登录号 NP_002178、P29460、AAG32620、AAH74723、AAH67502、AAH67499、AAH67498、AAH67501或这些序列的天然存在的变体的任一个中所述的序列。所有这些序列在此完整引入作为参考。

[0033] "白细胞介素-23R"或"IL-23R"意指由如NCBI蛋白质序列数据库登录号NP653302 (IL23R，Gene ID: 149233)或其天然存在的变体中所述的人IL-23R的成熟形式的序列组成的单个多肽链。另外的IL-23R序列变体公开于WO 01/23556和WO 02/29060中。
所有这些序列和文献在此完整引入作为参考。

[0034] "白细胞介素-12Rβ1"或"IL-12Rβ1"意指由如NCBI蛋白质序列数据库登录号NP_714912、NP_005526 (IL12RB1, Gene ID: 35p4)或其天然存在的变体中所述的人
IL-12Rβ1的成熟形式的序列组成的单个多肽链。所有这些序列和文献在此完整引入作为参考。

[0035] 如本文中所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，组成群体的单个抗体除了可能天然发生的突变（其可以以少量存在）外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其指向单个抗原性表位。相反地，常规（多克隆）抗体制剂通常包括许多指向（或特异于）不同表位的抗体。修饰语"单克隆的" 表示如从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler等人 (1975) Nature 256: 495首先描述的杂交瘤方法制造，或可通过重组DNA方法（例如参照，美国专利号4,816,567)制造。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等人 (1991) Nature 352: 624-628和Marks等人 (1991) J. MoI.Biol. 222: 581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。

[0036] 本文中的单克隆抗体明确地包括“嵌合”抗体（免疫球蛋白）（其中一部分重链和/或轻链与源自特定种类或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，而链的其余部分与源自另一种类或属于另一抗体种类或亚类的抗体的相应序列同一或同源）以及此类抗体的片段，只要它们展示期望的生物活性。美国专利号4,816,567；Morrison等人 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Sl : 6851-6855。

[0037] "结构域抗体"是只包含重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，通过肽连接体共价连接两个或更多个VH区来产生二价结构域抗体。
二价结构域抗体的两个VH区可靶向相同的或不同的抗原。

[0038] "二价抗体"包含两个抗原结合部位。在一些情况下，两个结合部位具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双异性的。

[0039] 如本文中所使用的，术语"单链Fv"或"scFv"抗体是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般地，所述Fv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽连接体，该连接体使得scFv能够形成用于抗原结合的期望的结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, 第
113卷, Rosenburg和Moore eds. Springer- Verlag, New York, pp. 269-315。

[0040] 本文中的单克隆抗体还包括骆驼化的（camelized）单结构域抗体。参见，例如，Muyldermans等人 (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230；Reichmann等人 (1999) J.Immunol. Methods 231 :25；WO 94/04678；WO 94/25591；美国专利号6,005,079)。在一个实施方案中，本发明提供了单结构域抗体，所述抗体包含两个具有修饰（以便形成单结构域抗体）的VH结构域。

[0041] 如本文中所使用的，术语"双体"是指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，所述片段在相同的多肽链(VH-VL或VL-VH)上包含连接的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。通过使用太短以至不允许相同链上的两个结构域之间配对的连接体，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位。双体更详细地描述于例
如EP 404,097；WO 93/11161和Holliger等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
6444-6448中。关于工程改造的抗体变体的综述，参见Holliger和Hudson (2005) Nat.
Biotechnol. 23:1126-1136。

[0042] 如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指包含来自非人（例如，鼠）抗体以及人抗体的序列的抗体形式。此类抗体包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。一般地，人源化抗体可包含基本上至少一个，通常两个可变结构域的全部，其中高变环的全部或基本上全部相应于非人免疫球蛋白的高变环并且FR区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选地也可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)（通常人免疫球蛋白的恒定
区）的至少一部分。当必需将人源化抗体与亲本啮齿类动物抗体相同区别时，为抗体克隆名称加上前缀"hum"、"hu" 或"h" （尽管取决于上下文，这些相同的名称也可指明特定蛋白质的人形式）。啮齿类动物抗体的人源化形式通常包含亲本啮齿类动物抗体的相同CDR序列，虽然可包含某些氨基酸置换来增加人源化抗体的亲和力、增加其稳定性或出于其他原因。

[0043] 抗体还包括具有经修饰的（或经封闭的）Fc区域（以提供改变的效应子功能）的抗体。参见例如，美国专利号5,624,821；WO 2003/086310；WO 2005/120571；WO
2006/0057702；Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656。此类修饰可用于增强或抑制免疫系统的各种反应，在诊断和治疗中具有可能的有益作用。Fc区域的改变包括氨基酸的变化(置换、缺失和插入)、糖基化或去糖基化以及添加多个Fc。对Fc的改变还可改变治疗性抗体的抗体半衰期。更长的半衰期可导致更低频率的给药，伴随着增加的方便和减少的材料使用。参见Presta (2005) J. Allergy CHn. Immunol.116:731 at 734-35。

[0044] 抗体还包括具有提供完全效应子功能的完整Fc区域的抗体，例如人同种型IgG1的抗体，其在靶细胞中诱导补体依赖的细胞毒性(CDC)或抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，施用本发明的抗体以从细胞群体中选择性耗尽表达关连抗原（cognate antigen）的细胞。

[0045] 术语“完全人抗体”是指只包含人免疫球蛋白序列的抗体。如果在小鼠中，在小鼠细胞中或在来源于小鼠细胞的杂交瘤中产生，那么完全人抗体可包含鼠类糖链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”是指分别只包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。完全人抗体可利用噬菌体展示或其他分子生物学方法在人类中，在具有人免疫球蛋白种系序列的转基因动物中产生。

[0046] “结合化合物”是指能够结合靶的分子、小分子、高分子、多肽、抗体或其片段或类似物或可溶性受体。"结合化合物"还可以指分子的复合物，例如非共价复合物，离子化的分子以及共价或非共价地修饰的分子，例如通过磷酸化、酰化、交联、环化或有限切割修饰的分子，所述分子能够结合靶。当用于指抗体时，术语“结合化合物”是指抗体和其抗原结合片段。“结合”是指结合化合物与靶的缔合，其中在其中结合化合物可溶解或悬浮在溶液中的情况下，所述缔合导致结合化合物的正常布朗运动减少。"结合组合物"是指与稳定剂、赋形剂、盐、缓冲剂、溶液或添加剂组合的分子例如结合化合物，其能够结合靶。

[0047] 预期的方法的抗体或来源于抗体的抗原结合部位的结合组合物以比对于无关抗原的亲和力大至少在1倍，优选大至少2倍，优选大至少大9倍，更优选大至少大19倍和
最优选大至少大99倍的亲和力结合其抗原。在优选实施方案中，抗体可具有如例如通
9
过Scatchard分析测定的大于约10 升/mol的亲和力。Munsen等人 (1980) Analyt.
Biochem. 107:220-239。

[0048] II. 不含动物产物/不含水解产物的生产给料添加剂本发明基于消除对于在哺乳动物(例如CHO)细胞培养中生产单克隆抗体和蛋白质生
物制剂中对动物成分和成分不明确的蛋白质水解产物的依赖的期望。结果是在小规模生物反应器中具有比补充有大豆水解产物的培养物的效价高25%的生产收得率以及在摇瓶研
究中具有为不使用任意添加剂的培养物的效价的2倍的生产收得率的化学成分确定的生
产给料添加剂。参见图2。使用该改进DMEM/F12浓缩物产生的蛋白质的纯度可与使用含水解产物的添加剂产生的蛋白质的纯度相当。

[0049] 在一个实施方案中，本发明提供了不含动物成分和蛋白质水解产物的高产单克隆抗体(mAb)生产给料添加剂。此类添加剂以增加的效价产生mAb，该mAb具有可与使用水解产物的常规方法相比较的产品质量概括（product quality profile）。

[0050] 在一些实施方案中，所述添加剂可用于培养细胞以产生例如通过p19亚基特异性结合人IL-23的治疗性抗体或其抗原结合片段。结合人IL-23p19的示例性抗体公开了通常指定的国际专利申请公开号. WO 2008/103432中。在其他实施方案中，所述培养基可用于产生其他蛋白质，包括特异性结合除了IL-23p19外的蛋白质的抗体，包括抗体片段或衍生物、细胞因子、细胞因子受体、生长因子、用作疫苗的多肽和甚至非治疗性蛋白质。

[0051] 本发明的生长培养基添加剂（称为“SP给料”）基于补充有维生素E和亚硒酸钠 (Na2SeO3)的改进的DMEM/F12基础培养基浓缩制物。已报导了另一个用于抗体生产的进料方案，其包括利用DMEM/F12和亚硒酸钠的补充。Zhou等人 (1997) Cytotechnology 24:99。

[0052] 进料策略基于顺流进料原理，其中引入细胞培养物的营养物的量基于营养物消耗和细胞的生长速率。参见，例如，Zhou等人 (1997) Cytotechnology 24:99。在摇瓶中和小规模搅拌釜式生物反应器（small-scale stirred tank bioreactors）(STR)中测试本发明的培养基和方法。同时评价生产过程的特征和产物评估。将摇瓶用于评估参数例如细胞生长的一般特征、作为温度的函数的生长、基础培养基和给料培养基的作用和细胞系的初步稳定性估计。平行地，将STR用于研究新型生产给料培养基在更受控制的环境中的可行性。分析并且监控随营养物给料和过程参数变化而发生的生理变化以减少产物偏差（product deviation）。

[0053] 在一个方面，本发明涉及培养哺乳动物细胞例如CHO细胞以产生治疗性多肽例如抗体的方法。申请者通过使用每天补充SP给料，研究培养中的数个抗体生产细胞系以测定细胞生长和营养物消耗率为最高时的时间。申请者发现每4g葡萄糖消耗1g谷氨酰胺，从而导致SP给料中的1:4的谷氨酰对葡萄糖的比率。申请者还发现对于至少一些细胞系可
能通过在生产运行使用有限次数的批式进料（bolus feed）而非每日给料来获得高抗体效价和产量。可以例如在接种后例如第3、5和10天以3次一次性进料来进行进料。进料次
数的减少极大地简化了生产运行，这在大规模生产运行（例如用于制备临床材料）中是特别有价值的。因此，在一个实施方案中，所述方法包括在生产运行期间的一次或多次一次性进料，例如，1、2、3、4、5或更多次一次性进料。此类进料优选在培养物中的营养物耗尽之前进行，以便最优化细胞活力和生产力。在一些情况下，此类进料可在接种后第3、5和10天发生。

[0054] 如图1A中所显示的，SP给料相对当用大豆水解产物（用于蛋白质生产的常用添加剂）补充细胞时获得的效价增加抗体的终效价约20%至80%。本发明的给料添加剂还可与其他添加剂例如大豆水解产物组合使用，以使一些细胞系的产量再增加一些。图1B显示大豆水解产物增加产量20%，SP给料增加产量大于70%，而组合增加产生抗体B的细胞系的产量90%。

[0055] 如图2A至2D中所举例说明的，对于许多不同的抗体，使用SP给料的补充相对于使用大豆水解产物的补充提高效价约20%至60%。在生物反应器和摇瓶(图2 A和2B)中
使用SP给料的效价更高，对于两种添加剂，与使用摇瓶相比较，在生物反应器中效价高20 - 33 %(数据未显示)。

[0056] 用于结果示于图1A、1B和2A至2D中的实验的抗体概述于表1中。

[0057] 表1 用于评估使用SP给料效价增加的抗体抗体来源分类
A 人源化大鼠 IgG1/κ
B 完全人 IgG1/κ
C 人源化大鼠 IgG1/κ
D 人源化小鼠 IgG1/κ
E 人源化小鼠 IgG1/κ
F 人源化小鼠 IgG4/κ

[0058] 如图3中所显示的，与生长培养基添加剂无关，在34℃下生长的培养物具有比在37℃下生长的培养物更高的效价。利用SP给料的补充与利用大豆水解产物的补充相比较
提高了抗体效价，并且两种添加剂的组合使效价又增加一些。

[0059] III. 产生抗体的细胞的表征待产生的抗体的质量和纯度可受到生产细胞的生理变化影响。因此，还表征了本发明
的给料添加剂对细胞生理学的几个方面的作用。测量细胞的DNA含量以测定细胞在细胞周期内的分布（数据未显示），测定凋亡状态以估计细胞的活力(图4)，测定细胞结合的mAb以估计生产率(图5)。所有3个参数可以例如使用FACSCalibur多用途流式细胞仪系统(BD
Biosciences, San Jose, Calif., USA)通过流式细胞术来进行测定。

[0060] 利用碘化丙啶染色通过流式细胞术来分析细胞DNA分布。细胞周期的G0/G1、S和G2/M期的百分比分析显示补充有SP给料的培养物在细胞周期中产生了与使用大豆水解产物补充的培养物相似的分布。

[0061] 通过膜联蛋白V结合(使用FITC-标记的膜联蛋白)和碘化丙啶(PI)染色分析细胞的凋亡状态。参见，例如，Vermes等人(1995) J. Immunol. Methods (1995) 184:39；
Moore等人 (1998) Methods Cell Biol. 57:265；Tait (2008) J. Nucl. Med. 49:1573。
图4显示在生产的第13和19天，与补充有大豆水解产物的培养物中的细胞相比较，在活力门控 (左下LL象限)中发现更高百分比的来自补充有SP给料的培养物的细胞并且在晚期
细胞凋亡/坏死门控(右上UR象限)中发现更低的百分比。这样的结果表明SP给料为维
持细胞活力提供了更好的环境。此外，虽然两种给料都展示相当的每细胞中等荧光强度，但图5和表2（下面）显示补充有SP给料的培养物中的细胞在活力门控中显示比大豆水解产
物的添加剂条件更高的细胞百分比（第13和19天）。更多数量（population）的活细胞的净结果和每个细胞相当的收得率意味着补充有SP给料的培养物在第13天，和特别地第19
天产生显著更多的抗体。

[0062] 表2抗体产量和活力
。

[0063] IV. 抗IL-23抗体一般地，本发明的添加剂和方法可用于从任意哺乳动物细胞系产生任意蛋白质，并且
特别适用于利用培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产治疗性蛋白质。在一个非限定性实例中，治疗性蛋白质是抗体，例如抗人IL-23p19抗体(或其抗原结合片段)。在不同实施方
案中，抗人IL-23p19抗体包含通常被指定的国际专利申请公开号. WO 2008/103432（通过将其公开内容在此完整引入作为参考）中公开的人源化抗体例如抗体hul3B8的1、2、3、4、
5或6个CDR序列或重链和轻链可变结构域。在另一个实施方案中，抗人IL-23p19抗体与
抗体hul3B8竞争对人IL-23的结合。在另一个实施方案中，抗人IL-23p19抗体与hul3B8
结合人IL-23上的相同表位。在其他实施方案中，抗人IL-23p19抗体能够在交叉-阻断
测定（cross-blocking assay）中阻断人IL-23p19对由杂交瘤（由美国典型培养物保藏中心(ATCC - Manassas, Virginia, USA)按照布达佩斯条约于2006年8月17日以登记号
PTA-7803保藏）产生的抗体的结合。在其他实施方案中，抗人IL-23p19抗体与由ATCC在
登录号PTA-7803下保藏的杂交瘤产生的抗体结合相同的表位。在其他实施方案中，抗人
IL-23p19抗体与由ATCC在登录号PTA-7803下保藏的杂交瘤产生的抗体结合相同的CDR序
列。

[0064] 适合于使用本发明的培养基和方法的生产的其他抗IL-23p19抗体公开于例如通常被指定的国际申请公开号WO 2007/027714和WO 2008/103473中，通过将其公开内
容在此完整引入作为参考。其他抗IL-23抗体公开于例如美国专利号7,247,711 (属
于Centocor，公开抗IL-23p40特异性抗体)、美国专利申请公开号2007/0009526和
2007/0218064(属于Centocor, 公开抗IL-23p19抗体)、国际专利申请公开号. WO
2007/024846 (属于EliLilly, 公开抗IL-23p19抗体)和国际专利申请公开号. WO
2007/147019 (属于Zymogenetics, 公开抗IL-23p19和IL-17的双特异性抗体)，通过将
其公开内容在此完整引入作为参考。已在临床试验中的示例性IL-12/IL-23(抗p40)抗体
包括Centocor的完全人抗体ustekinumab (CNTO 1275)和Abbott的完全人抗体ABT-874。

[0065] 在不同的实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体包括抗原结合片段例如但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2和双体。

[0066] 通过参考下列实施例最好地理解本发明的广泛范围，所述实施例无意将本发明限定于特定的实施方案。实施例

[0067] 实施例1一般方法
描述了分子生物学中的一般方法。Maniatis等人 (1982) Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY；Sambrook和Russell (2001) Molecular Cloning, 第3版, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Wu (1993) Recombinant DNA, 第217
卷, Academic Press, San Diego, CA。标准方法也出现在Ausbel等人 (2001) Current Protocols in Molecular Biology, 第1至4卷, John Wiley和Sons, Inc. New York,
NY中，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)，哺乳动物细胞和酵母中的克隆
(第2卷)，糖辍合物和蛋白质表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷)。

[0068] 描述了用于蛋白质纯化的方法包括免疫沉淀法、层析、电泳、离心和结晶。Coligan等人 (2000) Current Protocols in Protein Science, 第1卷, John Wiley
和Sons, Inc., New York。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化。参见，例如，Coligan等人 (2000) Current Protocols in Protein
Science, 第2卷, John Wiley和Sons, Inc., New York；Ausubel等人 (2001) Current Protocols in Molecular Biology, 第3卷, John Wiley和Sons, Inc., NY, NY, pp.
16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO；pp. 45-89；Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory,
Piscataway, N.J., pp. 384-391。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化。
Coligan等人 (2001) Current Protocols in Immunology, 第1卷, John Wiley和
Sons, Inc., New York；Harlow和Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Harlow和Lane, 同上。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可获得的。参见，例如，Coligan等人 (2001) Current Protocols in Immunology, 第4卷, John Wiley, Inc., New York。

[0069] 进行流式细胞术的方法，包括荧光激活细胞分选检测系统(FACS®)，是可获得的。参见，例如，Owens等人 (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley和Sons, Hoboken, NJ；Givan (2001) Flow Cytometry, 第2版；
Wiley-Liss, Hoboken, NJ；Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley和Sons, Hoboken, NJ。适合用于修饰用作例如诊断剂的核酸包括核酸引物和探针、多肽以及抗体的荧光试剂是可获得的。Molecular Probes (2003) Catalog, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR；Sigma-Aldrich (2003) Catalog, St. Louis, MO。

[0070] 描述了免疫系统的组织学的标准方法。参见，例如，Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY；Hiatt,等人 (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams和Wilkins, Phila., PA；Louis,等人 (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY。

[0071] 使用商购可得的软件包括但不限于JMP® Statistical Discovery软件, SASInstitute Inc., Cary, North Carolina, USA进行统计分析。

[0072] 在例如国际专利申请公开号. WO 90/03430和美国专利号5,830,761（将其公开内容在此引入作为参考）中提供了细胞生长培养基和方法。

[0073] 实施例2抗体生产
如下使用本发明的给料添加剂和方法生产单克隆抗体。将表达抗体D（全长人源化IgG
抗人IL-23p19单克隆抗体）的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在通气摇瓶中于在基础培养基(BM)（其包含具有1 mL/L铁螯合剂C2115的C5467 CHO无蛋白质培养基(缺乏ATA) (两者都
来自Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA)、20 mL/L 200 mM谷氨酰胺(Gibco, Grand Island, New York, USA)以及各自1 mL/L的Cellgro微量元素A和Cellgro微量元素B(两
者都来自Mediatech, Manassas, Virginia, USA)）中进行系列传代培养。将细胞在37℃于潮湿的7.5% CO2 培养箱中进行温育，在Forma定轨振荡器平台(Thermo Scientific,
6
Waltham, Mass., USA)上以100 rpm搅拌摇瓶。当活细胞密度为1 - 2 x 10 个细胞/mL
时，以1:3的分流比传代培养CHO细胞。

[0074] 如下测定使用SP给料的补充对抗体(IgG)的产量的影响。在时间0上通过加入经热处理的大豆水解产物（使用200 g/L的原液）至5 g/L的终浓度来用大豆水解产物补充对照培养物。通过加入葡萄糖 (450 g/L)和谷氨酰胺(200 mM)的原液分别使葡萄糖和谷
氨酰胺维持在1.5 g/L和100 mg/L以上。

[0075] 用为20X的浓缩物的SP给料（其配方提供了表3中）补充其他培养物。SP给料基于补充有亚硒酸钠和维生素E (α-生育酚)的改进20X DMEM/F12培养基，如在表3中描
述的和在本文中其他地方描述的。以60 g/L提供葡萄糖(成分46)并且按照预定的1:4
的葡萄糖对谷氨酰胺消耗比将谷氨酰胺浓度(成分47)调整至15 g/L。

[0076] 表 3SP给料制剂
成分编号化合物浓度(g/L)
1 CuSO4-5H2O 0.000026
2 硝酸铁-9H2O 0.001
3 硫酸亚铁7H2O 0.00834
4 硫酸锌7H2O 0.00863
5 MgCl2 0.5722
6 MgSO4 0.9768
7 磷酸二氢钠H2O 1.25
8 磷酸氢二钠 1.4204
9 L-丙氨酸 0.0891
10 L-精氨酸HCI 2.9502
11 L-天冬酰胺H2O 0.15002
12 L-天冬氨酸 0.133
13 L-半胱氨酸HCI-H2O 0.35122
14 L-半胱氨酸 2HCI 0.62584
15 L-谷氨酸 0.14702
16 甘氨酸 0.37502
17 L-组氨酸 HCI-H2O 0.62964
18 L-异亮氨酸 1.08948
19 L-亮氨酸 1.18108
20 L-赖氨酸 HCI 1.82512
21 L-甲硫氨酸 0.34482
22 L-苯丙氨酸 0.70964
23 L-脯氨酸 0.34502
24 L-丝氨酸 0.52504
25 L-苏氨酸 1.06908
26 L-色氨酸 0.18042
27 L-酪氨酸2Na-2H2O 1.11588
28 L-缬氨酸 1.057
29 d-生物素 0.000074
30 D-Ca泛酸 0.0448
31 氯化胆碱 0.1796
32 叶酸 0.053
33 肌醇 0.252
34 烟酰胺 0.04037
35 吡哆醛HCI 0.04
36 吡多辛HCI 0.00062
37 核黄素 0.00438
38 硫胺HCI 0.0434
39 维生素B-12 0.0136
40 次黄嘌呤2NA 0.054
41 亚油酸 0.00084
42 硫辛酸 0.0021
43 腐胺2HCI 0.00162
44 丙酮酸钠 1.1
45 胸苷 0.0073
46 葡萄糖 60
47 谷氨酰胺 15
48 亚硒酸钠 0.0003
49 维生素E 0.0302 。

[0077] 将细胞在具有2L工作体积的布朗生物反应器(B. Braun Medical Inc.,Bethlehem, Pa., USA)中培养。将接种物在37℃和7.5% CO2覆盖（overlay）下于编织袋(wave bag)(Wave Biotech LLC, GE Healthcare, Somerset, NJ, USA)中扩大培养。在
pH 6.8, 60%的溶解氧(DO)和200 rpm的搅拌速率下操作生物反应器。最初将温度设置
在37℃，然后在第3、4或5天下调至34℃。通过喷射氧气来控制溶解氧并且通过加入1M
NaOH或CO2气体来控制pH。

[0078] 对于使用SP给料的分批给料，顺流进料基于一个指标-葡萄糖/谷氨酰胺比。通5
过下列公式测定给料体积，其中Q葡萄糖为0.019 g/10 个细胞/天的平均葡萄糖消耗比，Xn为在Tn下测量的活细胞密度以及C葡萄糖= 60 g/L
。

[0079] 使用Cedex自动细胞培养分析仪(Innovatis AG, Bielefeld, Germany)测量摇瓶和生物反应品中活细胞密度和总细胞密度。使用YSI 2000 分析仪(YSI, Yellow Springs Instruments Co., Ohio, USA)测定葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺和谷氨酸盐。利用NovaBioProf�le 100 plus 分析仪(Nova Biomedical Corp., Waltham, Mass., USA)测量氨。
利用Advanced Micro-Osmometer (Advanced Instruments, Norwood, Mass., USA)测量
重量摩尔渗透压浓度。利用ABL5分析仪(Radiometer America Inc., Westlake, Ohio,
USA)测量pH、pCO2、pO2。利用反相HPLC或蛋白质-A HPLC定量抗体。

[0080] 一旦已使用上述公式分析了给定的生产性细胞系的代表性培养次数以确定何时应当进行给料，并且如果此类培养物显示充分的重现性，那么可简单地以预定的次数对相同细胞的未来培养物进行给料而不必主动监控培养物。例如，可在接种后第3、5和10天对培养物给料。可选地，可在早期指数生长期、晚期指数生长期和静止期期间对培养物给料。

[0081] 对于一些本文中研究的培养物，3次每次6.67%体积的一次性进料(总补充为整个生产运行过程中培养物的工作体积的20%)足以支持高水平抗体产生。因此，每一次给料包括将表3的“20X”制剂在培养基中稀释至1.33X的终浓度。对于不可消耗的成分，第二和第三次一次性进料分别将浓度升高至2.66X和4X。如上文中所述，本文中报导的“X”浓度只基于给料添加剂所源自的20X DMEM/F12培养基，并且不反映任何具体的期望的工作（或终）浓度(例如"1X")。

[0082] 通过加入SP给料培养的细胞展示增强的细胞生长，在更迟的时间（例如，接种后第13和19天）上减少的细胞凋亡以及产生比未补充的培养物或只用大豆水解产物补充的培养物更高的抗体效价。在使用表达抗体D的CHO细胞系的实验中，与只用大平水解产物
补充的培养物相比较，在用SP给料补充的培养物中效价达到高出1倍。

[0083] 其他实验确认当在纯后利用反相（RP）和大小排阻（SEC）高效液相色谱（HPLC）测量时，从补充有SP给料的培养物产生的抗体具有与使用大豆水解产物给料制备的抗体相似的的特征。

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一种价格查询方法及设备-专利编号CN107066610A	2020-05-11	422
用于医疗辅助终端设备和后端设备的抗凝管理方法及装置-专利编号CN107292110A	2020-05-12	781
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用于哺乳动物细胞培养的给料添加剂及使用方法

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