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9. 发明专利

TWI320788B 純化抗體之方法 METHOD FOR THE PURIFICATION OF ANTIBODIES 有权
简体标题：纯化抗体之方法 METHOD FOR THE PURIFICATION OF ANTIBODIES
公开(公告)号：TWI320788B
公开(公告)日：2010-02-21
申请号：TW095118030
申请日：2006-05-19
申请人：赫孚孟拉羅股份公司
发明人：羅伯托佛肯斯丹 , 伯卡柯柏 , 馬利亞賽伯
IPC分类号： C07K , G01N
CPC分类号： C07K16/00 , B01D15/362 , B01D15/363 , B01D15/426 , C07K1/18 , C07K16/065 , C07K16/2866 , C07K16/32 , C07K2317/50 , G01N30/96
摘要：本發明描述一種藉由離子交換層析法純化免疫球蛋白之方法。該層析方法使用弱離子交換樹脂及單一步驟之溶離方法來純化免疫球蛋白。此外，本發明描述一種測定用於自離子交換樹脂以單一步驟溶離免疫球蛋白之鹽的濃度之方法。 A method for the purification of immunoglobulins by ion exchange chromatography is described. The chromatographic method uses a weak ion exchange resin and a single step elution process for the purification of an immunoglobulin. Additionally a method for the determination of the salt concentration for the single step elution of an immunoglobulin from an ion exchange resin is described. 【創作特點】因此，本發明之目標在於提供另一種用於純化重組產生之免疫球蛋白及分離單體及多聚體免疫球蛋白物種之方法。
本發明提供一種純化免疫球蛋白之方法，其中該方法包含以下步驟：a)提供包含免疫球蛋白、緩衝物質及視情況之鹽之溶液；b)在免疫球蛋白結合至弱離子交換材料之條件下使該溶液與該弱離子交換材料相接觸；c)藉由使用包含緩衝物質及鹽之溶液經單一步驟自該弱離子交換材料回收免疫球蛋白。
本發明進一步提供一種測定用於以單一步驟純化方法自離子交換層析材料溶離多肽之鹽濃度的方法，其包含以下兩個步驟：a)步驟1，其包含以下子步驟：a1)提供包含多肽、緩衝物質及視情況之鹽之溶液；a2)在多肽結合至離子交換材料之條件下使含有該多肽之第一等分溶液與該離子交換材料相接觸；a3)藉由使用包含緩衝物質及鹽之溶液自離子交換材料回收多肽，藉此線性增加鹽之濃度；a4)測定多肽之第一餾份開始自離子交換管柱溶離時該鹽之起始濃度；b)步驟2，其包含以下子步驟：b1)在多肽結合至離子交換材料之條件下使含有該多肽之第二等分溶液與該離子交換材料相接觸；b2)藉由使用三步驟之溶離方法自該離子交換材料回收多肽，藉此i)第一溶離步驟中之鹽濃度計算為步驟a4)中測定之鹽之起始濃度與該鹽分子式中表示之不同於氫之單價陽離子總數之乘積與緩衝鹽之濃度與該緩衝鹽分子式中表示之不同於氫之單價陽離子總數之乘積的總和；ii)第二溶離步驟之鹽濃度為第一溶離步驟之鹽濃度與1.25至1.35之間之因子的乘積；iii)第三溶離步驟之鹽濃度為第一溶離步驟之鹽濃度與1.50至1.70之間之因子的乘積；藉此步驟ii)及iii)中之因子如下判定：當起始濃度在10 mM與40 mM之間時，該等因子分別為1.35與1.70，當起始濃度在40 mM與70 mM之間時，該等因子分別為1.30與1.60，且當起始濃度大於70 mM時，該等因子分別為1.25與1.50。
b3)判定多肽在步驟b2)之三步驟溶離方法中之哪一子步驟自離子交換管柱溶離，藉此測定用於以單一步驟純化方法自離子交換層析材料溶離多肽之鹽的濃度。
在該申請案中根據以下定義使用該等術語：如該申請案所用之術語"離子交換樹脂"或"離子交換材料"表示具有共價結合之帶電取代基的固定高分子量基質。對於所有電中性而言，無共價結合之抗衡離子與其結合。"離子交換材料"具有將其未經共價結合之抗衡離子與周圍溶液中之類似帶電離子進行交換之能力。視其可交換抗衡離子之電荷而定，"離子交換樹脂"稱為陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂。視帶電基團(取代基)之性質而定，"離子交換樹脂"稱為(例如在陽離子交換樹脂之情況下)磺酸樹脂(S)或羧甲基樹脂(CM)。視帶電基團/取代基之化學性質而定，"離子交換樹脂"可視共價結合帶電取代基之強度而額外分為強或弱離子交換樹脂。例如，強陽離子交換樹脂具有磺酸基作為帶電取代基，弱陽離子交換樹脂具有羧基(較佳為羧甲基)作為帶電取代基，且弱陰離子交換樹脂具有二乙胺基乙基作為帶電取代基。
陽離子交換樹脂可以不同名稱購自多個公司，諸如Bio－Rex、Macro－Prep CM(購自Biorad Laboratories，Hercules，CA，USA)、弱陽離子交換劑WCX 2(購自Ciphergen，Fremont，CA，USA)、DowexMAC－3(購自Dow化學品公司－液體分離，Midland，MI，USA)、Mustang C(購自Pall Corporation，East Hills，NY，USA)、纖維素CM－23、CM－32、CM－52、hyper－D及partisphere(購自Whatman plc，Brentford，UK)、AmberliteIRC 76、IRC 747、IRC 748、GT 73(購自Tosoh Bioscience GmbH，Stuttgart，Germany)、CM 1500、CM 3000(購自BioChrom Labs，Terre Haute，IN，USA)及CM－Sepharose T M Fast Flow(購自GE Healthcare－Amersham Biosciences Europe GmbH，Freiburg，Germany)。
弱離子交換材料之帶電取代基較佳為至少約90%之羧酸基團，大於90%之羧酸基團，或大於95%之羧酸基團。
在本申請案中可交替使用之術語"單步驟溶離"及"單步驟梯度溶離"表示一種方法，其中例如引起溶離(意即結合化合物自材料溶解)之物質的濃度立即增加或降低，意即在單一步驟中直接自起始值/含量達到最終值/含量。
"多肽"為一種由肽鍵連接之胺基酸殘基之聚合物，不管其為天然產生或合成產生。少於約20個胺基酸殘基之多肽稱為"肽"。
"蛋白質"為包含一或多個多肽鏈之巨分子或多於100個胺基酸殘基之多肽鏈。蛋白質亦可包含非肽組份，諸如碳水化合物基團。碳水化合物及其他非肽取代基可藉由於其中產生蛋白質之細胞而添加至蛋白質中，且視細胞類型而改變。在本文中根據其胺基酸主鏈結構來定義蛋白質；通常不指定諸如碳水化合物基團之取代基，但其仍可存在。
在本申請案中可交替使用之術語"抗體"及"免疫球蛋白"包含至少兩個輕多肽鏈及兩個重多肽鏈。每一重及輕多肽鏈均含有可變區(通常為多肽鏈之胺基末端部分)，其含有結合結構域以供與抗原交互作用。每一重及輕多肽鏈亦均包含多肽鏈之恆定區(通常為羧基末端部分)，其可調節抗體與宿主組織或包括免疫系統之各種細胞、典型補體系統之某些吞噬細胞及第一組份(Clq)之因子的結合。輕及重多肽鏈一般為完整鏈，其每一者基本上由可變區(意即VL或VH)及完整恆定區(意即，在輕多肽鏈之情況下為CL，或在重多肽鏈之情況下為CH1、CH2、CH3且視情況之CH4)組成。根據本發明之抗體的可變區可接枝至其他同型之恆定區。例如，編碼1－同型重鏈可變區之聚核苷酸可接枝至編碼另一重鏈種類(或子類)之恆定區的聚核苷酸。
如本文所用之術語"抗體"或"免疫球蛋白"係指由一或多種大體上由抗體基因編碼之多肽組成之蛋白質。所識別之抗體基因包括不同之恆定區基因以及大量抗體可變區基因。抗體可以多種形式存在，例如包括Fv、Fab及F(ab)2以及單鏈(例如，Huston,J.S.等人，PNAS USA 85(1988)5879－5883；Bird等人，Science 242(1988)423－426；及一般而言，Hood等人，Immunology，Benjamin N.Y.，第2版(1984)及Hunkapiller及Hood，Nature 323(1986)15－16)。在一實施例中，根據本發明之抗體包含單株抗體及其片段，例如經分離之重鏈或輕鏈，或僅由恆定區及其片段組成之重鏈或輕鏈。
熟習此項技術者已知通用之層析方法及其使用。例如參見，Chromatography，第5版，A部分：Fundamentals and Techniques，Heftmann,E.(編)，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1992)；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences，Deyl,Z.(編)，Elsevier Science BV，Amsterdam，The Netherlands，(1998)；Chromatography Today，Poole，C.F.，及Poole，S.K.，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1991)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(1982)；Sambrook，J.等人(編)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；或Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等人(編)，John Wiley & Sons,Inc.，New York。
本發明提供一種用於純化免疫球蛋白之方法，其中該方法包含以下步驟：a)提供包含免疫球蛋白、緩衝物質及視情況之鹽之溶液；b)在免疫球蛋白結合至弱離子交換材料之條件下使該溶液與該弱離子交換材料相接觸；c)藉由使用包含緩衝物質及鹽之溶液經單一步驟自該弱離子交換材料回收免疫球蛋白。
免疫球蛋白之純化方法通常包含多步驟層析部分。在第一步驟中，藉由親和力層析法，例如以蛋白質A將非免疫球蛋白多肽及蛋白質自免疫球蛋白餾份中分離出來。之後可進行離子交換層析法以分離個別免疫球蛋白種類並移除痕量蛋白質A，其已自第一管柱共溶離。最後，需要第三層析步驟以自多聚體及相同種類之片段分離免疫球蛋白單體。有時聚集體的量較大(5%或更大)，且不可能在第三純化步驟中將其有效分離，因此需要進一步之純化步驟。
在重組產生特異性免疫球蛋白中，可無需用於分離不同免疫球蛋白種類之分離步驟。因此，對於重組產生之免疫球蛋白的總純化方法可減少至兩個層析步驟。
改良性蛋白質A溶離液通常經陽離子交換材料層析處理，其pH值低於各自免疫球蛋白之等電點。
在本發明之時，在吾人之實驗室中可獲得足量之抗IL－1R抗體(WO 2005/023872)及Herceptin(抗－HER2抗體(WO 99/57134))，且因此本發明例示為該兩種免疫球蛋白。同樣，本發明通常以免疫球蛋白來實踐。該例示性描述僅作為實例且非用於限制本發明。提供該等實例以助於理解本發明，其真實範疇陳述於附加之申請專利範圍中。
本發明描述一種用於自聚集體及其片段分離免疫球蛋白單體以及耗盡其他多肽雜質之純化方法。由實驗可見，該純化可藉由使用弱離子交換樹脂，較佳藉由使用弱陽離子交換樹脂來達成。如由強與弱離子交換材料之比較所例示，弱離子交換材料提供對於單體與聚集體形式之免疫球蛋白的分離(參見實例1及2及實例9及12)。
在本發明之一實施例中，緩衝材料(物質)之pH值為pH 3.0至pH 10.0，較佳為pH 3.0至pH 7.0，更佳為pH 4.0至pH 6.0且最佳為pH 4.5至pH 5.5。
在一實施例中，pH值在單一步驟中保持恆定，意即在單一步驟中維持相同值。
本發明之另一較佳項目在於本發明之方法可應用於在pH 6.0至pH 14之pH範圍內具有6.0或更高(pI6.0)之等電點(pI)且因此具有淨正電荷之免疫球蛋白。
本發明之較佳實施例為純化IgG或IgE種類之免疫球蛋白。
在本發明之較佳實施例中使用弱陽離子交換材料。
如例示，較佳採用濃度範圍介於5 mM至100 mM之間之緩衝材料。
為自弱離子交換材料回收結合免疫球蛋白，增加緩衝液/溶液之電導率。此可藉由增加緩衝鹽濃度或藉由向緩衝溶液中添加其他鹽(所謂溶離鹽)來實現。較佳溶離鹽為檸檬酸鈉、氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀，以及檸檬酸及磷酸之其他鹽，以及該等組份之任何混合物。尤其較佳為檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及其混合物。
引起溶離之鹽的濃度較佳介於5 mM與500 mM之間，更佳介於5 mM與400 mM之間，且尤其較佳介於5 mM與250 mM之間。
本發明之另一較佳實施例為引起溶離之鹽同時作為緩衝物質之用途，尤其為檸檬酸及其鹽或磷酸及其鹽。
本發明之方法較佳為層析或分批方法，尤其較佳為包含分批溶離之方法。
本發明之另一較佳實施例在於純化為單一步驟之純化方法。
"單一步驟"表示一種方法，其中一或多種條件，例如pH、離子強度、鹽濃度及/或層析流動自起始值突然變為最終值，意即該等條件與線性變化相比為增量變化，意即逐步變化。
本發明之又一較佳實施例在於該方法包含在該方法步驟a)之前藉由蛋白質A親和力層析法純化免疫球蛋白之額外步驟。
本發明進一步提供一種測定用於以單一步驟純化方法自離子交換層析材料溶離多肽之鹽濃度的方法，其包含以下兩個步驟：a)步驟1，其包含以下子步驟：a1)提供包含多肽、緩衝物質及視情況之鹽之溶液；a2)在多肽結合至離子交換材料之條件下使含有該多肽之第一等分溶液與該離子交換材料相接觸；a3)藉由使用包含緩衝物質及鹽之溶液自離子交換材料回收多肽，藉此線性增加鹽之濃度；a4)測定多肽之第一餾份開始自離子交換管柱溶離時該鹽之起始濃度；b)步驟2，其包含以下子步驟：b1)在多肽結合至離子交換材料之條件下使含有該多肽之第二等分溶液與該離子交換材料相接觸；b2)藉由使用三步驟之溶離方法自該離子交換材料回收多肽，藉此i)第一溶離步驟中之鹽濃度計算為步驟a4)中測定之鹽之起始濃度與該鹽分子式中表示之不同於氫之單價陽離子總數之乘積與緩衝鹽之濃度與該緩衝鹽分子式中表示之不同於氫之單價陽離子總數之乘積的總和；ii)第二溶離步驟之鹽濃度為第一溶離步驟之鹽濃度與1.25至1.35之間之因子的乘積；iii)第三溶離步驟之鹽濃度為第一溶離步驟之鹽濃度與1.50至1.70之間之因子的乘積；藉此步驟ii)及iii)中之因子如下判定：當起始濃度在10 mM與40 mM之間時，該等因子分別為1.35與1.70，當起始濃度在40 mM與70 mM之間時，該等因子分別為1.30與1.60，且當起始濃度大於70 mM時，該等因子分別為1.25與1.50；b3)判定多肽在步驟b2)之三步驟溶離方法中之哪一子步驟自離子交換管柱溶離，藉此測定用於以單一步驟純化方法自離子交換層析材料溶離多肽之鹽的濃度。
步驟b2)之因子界定了已由實驗所測定之範圍。該等值非絕對值，而僅為目標值。可維持10%之偏差。
本發明描述一種測定用於以單一步驟之用於自其他蛋白質材料純化多肽之純化方法自離子交換層析材料溶離多肽之鹽濃度的方法。
自離子交換樹脂開始溶離多肽(較佳為免疫球蛋白)之濃度為三步驟溶離方法之第二最優化步驟b)提供了基礎。用於溶離步驟之近似緩衝液/鹽濃度計算如下：－第一溶離步驟之鹽濃度等於第一被加數，由線性增加之鹽梯度所測定之自離子交換管柱開始溶離之鹽濃度與引起溶離之鹽分子式中表示之不同於氫之單價陽離子總數之乘積，與第二被加數，緩衝鹽之濃度與該緩衝鹽分子式中表示之不同於氫之單價陽離子總數之乘積的總和；－第二溶離步驟之鹽濃度等於第一溶離步驟之鹽濃度與1.25至1.35之間之因子的乘積；－第三溶離步驟之鹽濃度等於第一溶離步驟之鹽濃度與1.50至1.70之間之因子的乘積。
濃度計算步驟中所包括之因子說明了濃度水平之間之間隔且視起始濃度來調節。當起始濃度較小時，意即介於10 mM與40 mM之間時，該等因子分別為1.35及1.70，當為介於40 mM與70 mM之間之中等起始濃度時，該等因子分別為1.30及1.60，且當為大於70 mM之高起始濃度時，該等因子分別為1.25及1.50。該等因子界定了已由實驗所測定之範圍。該等值非絕對值，而僅為目標值。可維持10%之偏差。
在計算中須考慮緩衝鹽，因為如實例3中所概述，自離子交換樹脂溶離蛋白質可藉由在層析期間改變緩衝鹽濃度來實現。若緩衝鹽濃度在層析期間保持恆定或與引起溶離之鹽之起始濃度相比較小，則在計算期間可忽略以降低複雜性。
在一實施例中，引起溶離之鹽非緩衝鹽，且步驟b2i)之鹽濃度為由步驟a4)中之線性增加鹽梯度所測定之自離子交換管柱開始溶離之鹽濃度與引起溶離之鹽分子式中表示之不同於氫之單價陽離子總數的乘積。
將基於實例4以抗IL－1R抗體來例示計算。如實例3所測定，當起始濃度為由10 mM之緩衝液濃度及5 mM來自線性梯度之貢獻組成之15 mM檸檬酸鈉時，該三個步驟計算如下：－步驟一之目標濃度計算為30 mM(5 mM*2＋10 mM*2)檸檬酸鈉詳言之：5 mM(起始濃度)乘以2(檸檬酸為三價酸，採用二鈉鹽形式；因此分子式中存在兩個不同於氫之單價陽離子)加上10 mM(緩衝鹽濃度)乘以2(檸檬酸為三價酸，採用二鈉鹽形式；因此分子式中存在兩個不同於氫之單價陽離子)－步驟二之目標濃度計算為40.5 mM(30 mM * 1.35)檸檬酸鈉詳言之：30 mM檸檬酸鈉為步驟一之濃度，將其乘以1.35(起始濃度為15 mM，因此選擇因子1.35)－步驟三之目標濃度計算為51 mM(30 mM * 1.70)檸檬酸鈉詳言之：30 mM檸檬酸鈉為步驟一之濃度，將其乘以1.70(起始濃度為15 mM，因此選擇因子1.70)
由實驗可見，在一較佳實施例中，藉由使用弱離子交換材料，尤其較佳使用弱陽離子交換材料來達成該純化。
本發明之一較佳實施例在於多肽為免疫球蛋白，尤其較佳為IgG或IgE種類之免疫球蛋白。
在本發明之一實施例中，緩衝材料(物質)之pH值為pH 3.0至pH 10.0，較佳為pH 3.0至pH 7.0，更佳為pH 4.0至pH 6.0且最佳為pH 4.5至pH 5.5。
本發明之另一較佳項目在於本發明之方法可應用於在pH 6.0至pH 14之pH範圍內具有6.0或更高(pI6.0)之等電點(pI)且因此具有淨正電荷之免疫球蛋白。
如例示，較佳採用濃度範圍介於5 mM至100 mM之間之緩衝材料。
為自離子交換材料回收結合免疫球蛋白，增加緩衝液/溶液之電導率。此可藉由增加緩衝鹽濃度或藉由向緩衝溶液中添加其他鹽(所謂溶離鹽)來實現。較佳溶離鹽為檸檬酸鈉、氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀，以及檸檬酸及磷酸之其他鹽，以及該等組份之任何混合物。尤其較佳為檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及其任何混合物。
引起溶離之鹽的濃度較佳介於5 mM與500 mM之間，更佳介於5 mM與400 mM之間，且尤其較佳介於5 mM與250 mM之間。
本發明之另一較佳實施例為引起溶離之鹽同時作為緩衝物質之用途，尤其為檸檬酸及其鹽或磷酸及其鹽。
本發明之方法較佳為層析或分批方法，尤其較佳為包含分批溶離之方法。
本發明之另一較佳實施例在於純化為單一步驟之純化方法。
本發明之又一較佳實施例在於該方法包含在該方法步驟a)之前藉由蛋白質A親和力層析法純化免疫球蛋白之額外步驟。
简体摘要：本发明描述一种借由离子交换层析法纯化免疫球蛋白之方法。该层析方法使用弱离子交换树脂及单一步骤之溶离方法来纯化免疫球蛋白。此外，本发明描述一种测定用于自离子交换树脂以单一步骤溶离免疫球蛋白之盐的浓度之方法。 A method for the purification of immunoglobulins by ion exchange chromatography is described. The chromatographic method uses a weak ion exchange resin and a single step elution process for the purification of an immunoglobulin. Additionally a method for the determination of the salt concentration for the single step elution of an immunoglobulin from an ion exchange resin is described. 【创作特点】因此，本发明之目标在于提供另一种用于纯化重组产生之免疫球蛋白及分离单体及多聚体免疫球蛋白物种之方法。本发明提供一种纯化免疫球蛋白之方法，其中该方法包含以下步骤：a)提供包含免疫球蛋白、缓冲物质及视情况之盐之溶液；b)在免疫球蛋白结合至弱离子交换材料之条件下使该溶液与该弱离子交换材料相接触；c)借由使用包含缓冲物质及盐之溶液经单一步骤自该弱离子交换材料回收免疫球蛋白。本发明进一步提供一种测定用于以单一步骤纯化方法自离子交换层析材料溶离多肽之盐浓度的方法，其包含以下两个步骤：a)步骤1，其包含以下子步骤：a1)提供包含多肽、缓冲物质及视情况之盐之溶液；a2)在多肽结合至离子交换材料之条件下使含有该多肽之第一等分溶液与该离子交换材料相接触；a3)借由使用包含缓冲物质及盐之溶液自离子交换材料回收多肽，借此线性增加盐之浓度；a4)测定多肽之第一馏份开始自离子交换管柱溶离时该盐之起始浓度；b)步骤2，其包含以下子步骤：b1)在多肽结合至离子交换材料之条件下使含有该多肽之第二等分溶液与该离子交换材料相接触；b2)借由使用三步骤之溶离方法自该离子交换材料回收多肽，借此i)第一溶离步骤中之盐浓度计算为步骤a4)中测定之盐之起始浓度与该盐分子式中表示之不同于氢之单价阳离子总数之乘积与缓冲盐之浓度与该缓冲盐分子式中表示之不同于氢之单价阳离子总数之乘积的总和；ii)第二溶离步骤之盐浓度为第一溶离步骤之盐浓度与1.25至1.35之间之因子的乘积；iii)第三溶离步骤之盐浓度为第一溶离步骤之盐浓度与1.50至1.70之间之因子的乘积；借此步骤ii)及iii)中之因子如下判定：当起始浓度在10 mM与40 mM之间时，该等因子分别为1.35与1.70，当起始浓度在40 mM与70 mM之间时，该等因子分别为1.30与1.60，且当起始浓度大于70 mM时，该等因子分别为1.25与1.50。 b3)判定多肽在步骤b2)之三步骤溶离方法中之哪一子步骤自离子交换管柱溶离，借此测定用于以单一步骤纯化方法自离子交换层析材料溶离多肽之盐的浓度。在该申请案中根据以下定义使用该等术语：如该申请案所用之术语"离子交换树脂"或"离子交换材料"表示具有共价结合之带电取代基的固定高分子量基质。对于所有电中性而言，无共价结合之抗衡离子与其结合。"离子交换材料"具有将其未经共价结合之抗衡离子与周围溶液中之类似带电离子进行交换之能力。视其可交换抗衡离子之电荷而定，"离子交换树脂"称为阳离子交换树脂或阴离子交换树脂。视带电基团(取代基)之性质而定，"离子交换树脂"称为(例如在阳离子交换树脂之情况下)磺酸树脂(S)或羧甲基树脂(CM)。视带电基团/取代基之化学性质而定，"离子交换树脂"可视共价结合带电取代基之强度而额外分为强或弱离子交换树脂。例如，强阳离子交换树脂具有磺酸基作为带电取代基，弱阳离子交换树脂具有羧基(较佳为羧甲基)作为带电取代基，且弱阴离子交换树脂具有二乙胺基乙基作为带电取代基。阳离子交换树脂可以不同名称购自多个公司，诸如Bio－Rex、Macro－Prep CM(购自Biorad Laboratories，Hercules，CA，USA)、弱阳离子交换剂WCX 2(购自Ciphergen，Fremont，CA，USA)、DowexMAC－3(购自Dow化学品公司－液体分离，Midland，MI，USA)、Mustang C(购自Pall Corporation，East Hills，NY，USA)、纤维素CM－23、CM－32、CM－52、hyper－D及partisphere(购自Whatman plc，Brentford，UK)、AmberliteIRC 76、IRC 747、IRC 748、GT 73(购自Tosoh Bioscience GmbH，Stuttgart，Germany)、CM 1500、CM 3000(购自BioChrom Labs，Terre Haute，IN，USA)及CM－Sepharose T M Fast Flow(购自GE Healthcare－Amersham Biosciences Europe GmbH，Freiburg，Germany)。弱离子交换材料之带电取代基较佳为至少约90%之羧酸基团，大于90%之羧酸基团，或大于95%之羧酸基团。在本申请案中可交替使用之术语"单步骤溶离"及"单步骤梯度溶离"表示一种方法，其中例如引起溶离(意即结合化合物自材料溶解)之物质的浓度立即增加或降低，意即在单一步骤中直接自起始值/含量达到最终值/含量。 "多肽"为一种由肽键连接之氨基酸残基之聚合物，不管其为天然产生或合成产生。少于约20个氨基酸残基之多肽称为"肽"。 "蛋白质"为包含一或多个多肽链之巨分子或多于100个氨基酸残基之多肽链。蛋白质亦可包含非肽组份，诸如碳水化合物基团。碳水化合物及其他非肽取代基可借由于其中产生蛋白质之细胞而添加至蛋白质中，且视细胞类型而改变。在本文中根据其氨基酸主链结构来定义蛋白质；通常不指定诸如碳水化合物基团之取代基，但其仍可存在。在本申请案中可交替使用之术语"抗体"及"免疫球蛋白"包含至少两个轻多肽链及两个重多肽链。每一重及轻多肽链均含有可变区(通常为多肽链之胺基末端部分)，其含有结合结构域以供与抗原交互作用。每一重及轻多肽链亦均包含多肽链之恒定区(通常为羧基末端部分)，其可调节抗体与宿主组织或包括免疫系统之各种细胞、典型补体系统之某些吞噬细胞及第一组份(Clq)之因子的结合。轻及重多肽链一般为完整链，其每一者基本上由可变区(意即VL或VH)及完整恒定区(意即，在轻多肽链之情况下为CL，或在重多肽链之情况下为CH1、CH2、CH3且视情况之CH4)组成。根据本发明之抗体的可变区可接枝至其他同型之恒定区。例如，编码1－同型重链可变区之聚核苷酸可接枝至编码另一重链种类(或子类)之恒定区的聚核苷酸。如本文所用之术语"抗体"或"免疫球蛋白"系指由一或多种大体上由抗体基因编码之多肽组成之蛋白质。所识别之抗体基因包括不同之恒定区基因以及大量抗体可变区基因。抗体可以多种形式存在，例如包括Fv、Fab及F(ab)2以及单链(例如，Huston,J.S.等人，PNAS USA 85(1988)5879－5883；Bird等人，Science 242(1988)423－426；及一般而言，Hood等人，Immunology，Benjamin N.Y.，第2版(1984)及Hunkapiller及Hood，Nature 323(1986)15－16)。在一实施例中，根据本发明之抗体包含单株抗体及其片段，例如经分离之重链或轻链，或仅由恒定区及其片段组成之重链或轻链。熟习此项技术者已知通用之层析方法及其使用。例如参见，Chromatography，第5版，A部分：Fundamentals and Techniques，Heftmann,E.(编)，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1992)；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences，Deyl,Z.(编)，Elsevier Science BV，Amsterdam，The Netherlands，(1998)；Chromatography Today，Poole，C.F.，及Poole，S.K.，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1991)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(1982)；Sambrook，J.等人(编)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；或Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等人(编)，John Wiley & Sons,Inc.，New York。本发明提供一种用于纯化免疫球蛋白之方法，其中该方法包含以下步骤：a)提供包含免疫球蛋白、缓冲物质及视情况之盐之溶液；b)在免疫球蛋白结合至弱离子交换材料之条件下使该溶液与该弱离子交换材料相接触；c)借由使用包含缓冲物质及盐之溶液经单一步骤自该弱离子交换材料回收免疫球蛋白。免疫球蛋白之纯化方法通常包含多步骤层析部分。在第一步骤中，借由亲和力层析法，例如以蛋白质A将非免疫球蛋白多肽及蛋白质自免疫球蛋白馏份中分离出来。之后可进行离子交换层析法以分离个别免疫球蛋白种类并移除痕量蛋白质A，其已自第一管柱共溶离。最后，需要第三层析步骤以自多聚体及相同种类之片段分离免疫球蛋白单体。有时聚集体的量较大(5%或更大)，且不可能在第三纯化步骤中将其有效分离，因此需要进一步之纯化步骤。在重组产生特异性免疫球蛋白中，可无需用于分离不同免疫球蛋白种类之分离步骤。因此，对于重组产生之免疫球蛋白的总纯化方法可减少至两个层析步骤。改良性蛋白质A溶离液通常经阳离子交换材料层析处理，其pH值低于各自免疫球蛋白之等电点。在本发明之时，在吾人之实验室中可获得足量之抗IL－1R抗体(WO 2005/023872)及Herceptin(抗－HER2抗体(WO 99/57134))，且因此本发明例示为该两种免疫球蛋白。同样，本发明通常以免疫球蛋白来实践。该例示性描述仅作为实例且非用于限制本发明。提供该等实例以助于理解本发明，其真实范畴陈述于附加之申请专利范围中。本发明描述一种用于自聚集体及其片段分离免疫球蛋白单体以及耗尽其他多肽杂质之纯化方法。由实验可见，该纯化可借由使用弱离子交换树脂，较佳借由使用弱阳离子交换树脂来达成。如由强与弱离子交换材料之比较所例示，弱离子交换材料提供对於单体与聚集体形式之免疫球蛋白的分离(参见实例1及2及实例9及12)。在本发明之一实施例中，缓冲材料(物质)之pH值为pH 3.0至pH 10.0，较佳为pH 3.0至pH 7.0，更佳为pH 4.0至pH 6.0且最佳为pH 4.5至pH 5.5。在一实施例中，pH值在单一步骤中保持恒定，意即在单一步骤中维持相同值。本发明之另一较佳项目在于本发明之方法可应用于在pH 6.0至pH 14之pH范围内具有6.0或更高(pI6.0)之等电点(pI)且因此具有净正电荷之免疫球蛋白。本发明之较佳实施例为纯化IgG或IgE种类之免疫球蛋白。在本发明之较佳实施例中使用弱阳离子交换材料。如例示，较佳采用浓度范围介于5 mM至100 mM之间之缓冲材料。为自弱离子交换材料回收结合免疫球蛋白，增加缓冲液/溶液之电导率。此可借由增加缓冲盐浓度或借由向缓冲溶液中添加其他盐(所谓溶离盐)来实现。较佳溶离盐为柠檬酸钠、氯化钠、硫酸钠、磷酸钠、氯化钾、硫酸钾、磷酸钾，以及柠檬酸及磷酸之其他盐，以及该等组份之任何混合物。尤其较佳为柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾及其混合物。引起溶离之盐的浓度较佳介于5 mM与500 mM之间，更佳介于5 mM与400 mM之间，且尤其较佳介于5 mM与250 mM之间。本发明之另一较佳实施例为引起溶离之盐同时作为缓冲物质之用途，尤其为柠檬酸及其盐或磷酸及其盐。本发明之方法较佳为层析或分批方法，尤其较佳为包含分批溶离之方法。本发明之另一较佳实施例在于纯化为单一步骤之纯化方法。 "单一步骤"表示一种方法，其中一或多种条件，例如pH、离子强度、盐浓度及/或层析流动自起始值突然变为最终值，意即该等条件与线性变化相比为增量变化，意即逐步变化。本发明之又一较佳实施例在于该方法包含在该方法步骤a)之前借由蛋白质A亲和力层析法纯化免疫球蛋白之额外步骤。本发明进一步提供一种测定用于以单一步骤纯化方法自离子交换层析材料溶离多肽之盐浓度的方法，其包含以下两个步骤：a)步骤1，其包含以下子步骤：a1)提供包含多肽、缓冲物质及视情况之盐之溶液；a2)在多肽结合至离子交换材料之条件下使含有该多肽之第一等分溶液与该离子交换材料相接触；a3)借由使用包含缓冲物质及盐之溶液自离子交换材料回收多肽，借此线性增加盐之浓度；a4)测定多肽之第一馏份开始自离子交换管柱溶离时该盐之起始浓度；b)步骤2，其包含以下子步骤：b1)在多肽结合至离子交换材料之条件下使含有该多肽之第二等分溶液与该离子交换材料相接触；b2)借由使用三步骤之溶离方法自该离子交换材料回收多肽，借此i)第一溶离步骤中之盐浓度计算为步骤a4)中测定之盐之起始浓度与该盐分子式中表示之不同于氢之单价阳离子总数之乘积与缓冲盐之浓度与该缓冲盐分子式中表示之不同于氢之单价阳离子总数之乘积的总和；ii)第二溶离步骤之盐浓度为第一溶离步骤之盐浓度与1.25至1.35之间之因子的乘积；iii)第三溶离步骤之盐浓度为第一溶离步骤之盐浓度与1.50至1.70之间之因子的乘积；借此步骤ii)及iii)中之因子如下判定：当起始浓度在10 mM与40 mM之间时，该等因子分别为1.35与1.70，当起始浓度在40 mM与70 mM之间时，该等因子分别为1.30与1.60，且当起始浓度大于70 mM时，该等因子分别为1.25与1.50；b3)判定多肽在步骤b2)之三步骤溶离方法中之哪一子步骤自离子交换管柱溶离，借此测定用于以单一步骤纯化方法自离子交换层析材料溶离多肽之盐的浓度。步骤b2)之因子界定了已由实验所测定之范围。该等值非绝对值，而仅为目标值。可维持10%之偏差。本发明描述一种测定用于以单一步骤之用于自其他蛋白质材料纯化多肽之纯化方法自离子交换层析材料溶离多肽之盐浓度的方法。自离子交换树脂开始溶离多肽(较佳为免疫球蛋白)之浓度为三步骤溶离方法之第二最优化步骤b)提供了基础。用于溶离步骤之近似缓冲液/盐浓度计算如下：－第一溶离步骤之盐浓度等于第一被加数，由线性增加之盐梯度所测定之自离子交换管柱开始溶离之盐浓度与引起溶离之盐分子式中表示之不同于氢之单价阳离子总数之乘积，与第二被加数，缓冲盐之浓度与该缓冲盐分子式中表示之不同于氢之单价阳离子总数之乘积的总和；－第二溶离步骤之盐浓度等于第一溶离步骤之盐浓度与1.25至1.35之间之因子的乘积；－第三溶离步骤之盐浓度等于第一溶离步骤之盐浓度与1.50至1.70之间之因子的乘积。浓度计算步骤中所包括之因子说明了浓度水平之间之间隔且视起始浓度来调节。当起始浓度较小时，意即介于10 mM与40 mM之间时，该等因子分别为1.35及1.70，当为介于40 mM与70 mM之间之中等起始浓度时，该等因子分别为1.30及1.60，且当为大于70 mM之高起始浓度时，该等因子分别为1.25及1.50。该等因子界定了已由实验所测定之范围。该等值非绝对值，而仅为目标值。可维持10%之偏差。在计算中须考虑缓冲盐，因为如实例3中所概述，自离子交换树脂溶离蛋白质可借由在层析期间改变缓冲盐浓度来实现。若缓冲盐浓度在层析期间保持恒定或与引起溶离之盐之起始浓度相比较小，则在计算期间可忽略以降低复杂性。在一实施例中，引起溶离之盐非缓冲盐，且步骤b2i)之盐浓度为由步骤a4)中之线性增加盐梯度所测定之自离子交换管柱开始溶离之盐浓度与引起溶离之盐分子式中表示之不同于氢之单价阳离子总数的乘积。将基于实例4以抗IL－1R抗体来例示计算。如实例3所测定，当起始浓度为由10 mM之缓冲液浓度及5 mM来自线性梯度之贡献组成之15 mM柠檬酸钠时，该三个步骤计算如下：－步骤一之目标浓度计算为30 mM(5 mM*2＋10 mM*2)柠檬酸钠详言之：5 mM(起始浓度)乘以2(柠檬酸为三价酸，采用二钠盐形式；因此分子式中存在两个不同于氢之单价阳离子)加上10 mM(缓冲盐浓度)乘以2(柠檬酸为三价酸，采用二钠盐形式；因此分子式中存在两个不同于氢之单价阳离子)－步骤二之目标浓度计算为40.5 mM(30 mM * 1.35)柠檬酸钠详言之：30 mM柠檬酸钠为步骤一之浓度，将其乘以1.35(起始浓度为15 mM，因此选择因子1.35)－步骤三之目标浓度计算为51 mM(30 mM * 1.70)柠檬酸钠详言之：30 mM柠檬酸钠为步骤一之浓度，将其乘以1.70(起始浓度为15 mM，因此选择因子1.70) 由实验可见，在一较佳实施例中，借由使用弱离子交换材料，尤其较佳使用弱阳离子交换材料来达成该纯化。本发明之一较佳实施例在于多肽为免疫球蛋白，尤其较佳为IgG或IgE种类之免疫球蛋白。在本发明之一实施例中，缓冲材料(物质)之pH值为pH 3.0至pH 10.0，较佳为pH 3.0至pH 7.0，更佳为pH 4.0至pH 6.0且最佳为pH 4.5至pH 5.5。本发明之另一较佳项目在于本发明之方法可应用于在pH 6.0至pH 14之pH范围内具有6.0或更高(pI6.0)之等电点(pI)且因此具有净正电荷之免疫球蛋白。如例示，较佳采用浓度范围介于5 mM至100 mM之间之缓冲材料。为自离子交换材料回收结合免疫球蛋白，增加缓冲液/溶液之电导率。此可借由增加缓冲盐浓度或借由向缓冲溶液中添加其他盐(所谓溶离盐)来实现。较佳溶离盐为柠檬酸钠、氯化钠、硫酸钠、磷酸钠、氯化钾、硫酸钾、磷酸钾，以及柠檬酸及磷酸之其他盐，以及该等组份之任何混合物。尤其较佳为柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾及其任何混合物。引起溶离之盐的浓度较佳介于5 mM与500 mM之间，更佳介于5 mM与400 mM之间，且尤其较佳介于5 mM与250 mM之间。本发明之另一较佳实施例为引起溶离之盐同时作为缓冲物质之用途，尤其为柠檬酸及其盐或磷酸及其盐。本发明之方法较佳为层析或分批方法，尤其较佳为包含分批溶离之方法。本发明之另一较佳实施例在于纯化为单一步骤之纯化方法。本发明之又一较佳实施例在于该方法包含在该方法步骤a)之前借由蛋白质A亲和力层析法纯化免疫球蛋白之额外步骤。

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