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9. 发明专利

TWI319813B 區別產品中雞蛋與雞肉之檢驗方法 THE DETECTION METHOD FOR DIFFERENTIATING BETWEEN CHICKENS AND EGGS IN PRODUCTS 有权
简体标题：区别产品中鸡蛋与鸡肉之检验方法 THE DETECTION METHOD FOR DIFFERENTIATING BETWEEN CHICKENS AND EGGS IN PRODUCTS
公开(公告)号：TWI319813B
公开(公告)日：2010-01-21
申请号：TW096113211
申请日：2007-04-14
申请人：行政院衛生署藥物食品檢驗局
发明人：闕麗卿 , 崔秀煒 , 謝佩君 , 吳宗熹 , 施養志 , 陳樹功
IPC分类号： G01N
CPC分类号： C12Q1/6888
摘要：本發明係關於一種可作為區別食品或其他產品中，所含雞之成分係源自雞蛋或雞肉之檢驗方法，與可專一性檢測食品或其他產品中雞成分之引子對與探針，並可實際應用於市售食品或其他產品之檢測。 The invention relates to a detection method of differentiating eggs and chicken in foods or other products and primer pairs and probes used for specifically detecting chicken in foods or other products. The method, primer pairs and probes of the invention can be used in the detection of marketing foods and other products. 【創作特點】發明詳細說明
本發明係關於一種可作為鑑別食品或其他產品中，所含「雞」之成分，係源自雞蛋或雞肉(含其他雞蛋以外之雞之組織)之檢驗方法與可專一性檢測食品或其他產品中雞成分之引子對與探針，並可實際應用於市售食品或其他產品之檢測。
本發明提供一種鑑別食品或其他產品中所含雞之成分係源自雞蛋或雞肉之檢驗方法，其包括將雞之高度保留染色體基因與雞之高度保留粒線體基因作為模板設計專一性引子對；及使用所得專一性引子對針對待測檢體進行PCR反應；及使用與模板專一性雜交之探針偵測並定量DNA的增幅；其中如僅能檢測出雞之高度保留粒線體基因而未能檢測出高度保留染色體基因，則該食品僅含有雞蛋成分；如若同時檢測出雞之高度保留粒線體基因與高度保留染色體基因，則該檢測檢體含有雞肉成份。
本發明所稱「雞肉」意指雞蛋以外之其他雞組織之成份。
本發明所稱「雞蛋」意指雞蛋未受精或已受精但未高度分化，可供作人類食用者。
本發明係利用染色體基因(chromosomal genome)與粒線體基因(mitochondrial genome)拷貝數(copy number)與來源組織細胞數目之差異，並因而造成相當質量或體積之雞蛋與其他雞組織中，特定染色體基因與粒線體基因含量之大幅倍數差異，以區分食品或其他產品中，所含雞之成分係源自雞蛋或雞肉。
本發明所稱利用基因拷貝數之差異係指單一細胞中染色體基因與粒線體基因之拷貝數差異。真核生物之基因體可區分為染色體基因體與粒線體基因體，單一真核細胞之粒線體數量可高達上萬個，因此粒線體基因之拷貝數可達上萬套。在畜禽動物，單一細胞約含有5,000~10,000個粒線體(科學發展，405期：22~27)，故單一細胞中，染色體基因與粒線體基因之拷貝數差異倍數約可達10 4 倍以上。
本發明所稱利用成分來源組織細胞數目之差異係指雞蛋與其他雞肉組織之細胞數目差異。雞蛋為單一細胞或僅含少數細胞之組織，故一顆雞蛋(平均約55公克)與其質量或體積相等之其他雞肉組織相較，細胞數目之差異約為10 6 倍以上。
本發明根據上述事實與推論，選定一染色體基因與一粒線體基因，利用基因拷貝數與成分來源組織之細胞數目之差異，區分食品或其他產品中，所含雞之成分係源自雞蛋或雞肉。於單純之未受精雞蛋的情形，由於一顆雞蛋為單一細胞，因此若選定拷貝數低之染色體基因，則該基因DNA於一顆雞蛋中含量非常稀少，推測可能無法利用PCR技術進行DNA增幅，或是經PCR增幅DNA數量仍然稀少而難以偵測。然而，選定之粒線體基因在一顆雞蛋中可多達數百至數萬套，DNA含量相對較多，因此可輕易利用PCR技術檢測出。在其他雞肉組織(與一顆雞蛋質量或體積相等)情形，縱以選定單一細胞中僅一套之染色體基因為檢測標的，由於細胞數量多，而該基因總數量亦多，因此亦容易藉PCR增幅DNA後檢測出，而粒線體基因在其他雞肉組織情形，因其拷貝數與細胞數皆多，其總數量更多，必然可檢測出。於含雞蛋之加工食品情形，由於雞蛋成分被稀釋，染色體基因更是難以檢測，但粒線體基因則仍可能被檢測出。
根據本發明，同時以選定之雞的高度保留染色體基因與粒線體基因，檢測食品或相關產品檢體，若僅能檢測出高度保留之粒線體基因而未能檢測出高度保留之染色體基因(或檢測出之含量相當低)，則該食品僅含有雞蛋成分，若同時檢測出雞的高度保留之粒線體基因與染色體基因，則該食品檢體含有其他雞肉組織之成份(亦可能同時含有雞蛋)。
本發明根據上述事實與推論，較佳地，以雞之高度保留染色體基因與雞之高度保留粒線體基因為檢測對象，設計專一性引子對(primer pair)與探針(probe)，並利用即時PCR(real－time PCR)技術進行檢測，分析推算同一檢體中，受檢測染色體基因與粒線體基因含量之差異，可成功區分僅含雞蛋成分之檢體與含其他雞肉組織之檢體。
根據本發明，雞之高度保留染色體基因，係指任何衍生自普遍存在於雞之高度保留染色體基因，其包括，但不限於，肌肉生長抑制素(myostatin)基因、生長激素(growth hormone)基因、衛星基因(satellite gene)、β肌動蛋白(β－actin)基因、肌凝蛋白(myosin)基因或血紅素(hemoglobin)基因等。較佳地，雞之高度保留染色體基因係選自生長激素基因、肌肉生長抑制素基因及β肌動蛋白基因。更佳地，雞之高度保留染色體基因為生長激素基因。根據本發明，雞之高度保留粒線體基因，係指任何衍生自普遍存在於雞之高度保留粒線體基因，其包括，但不限於，12S核糖體RNA基因、16S核糖體RNA基因、細胞色素b(cytochrome b)基因、ATPase subunit 8基因或ATPase subunit 6基因等。較佳地，雞之高度保留粒線體基因係選自12S核糖體RNA基因、16S核糖體RNA基因、細胞色素b(cytochrome b)基因。更佳地，雞之高度保留粒線體基因為12S核糖體RNA基因。
亦可經由比對DNA序列資料庫或基因庫，確認其他普遍存在於雞之高度保留基因或DNA片段，以其為檢測對象，進行本發明之檢驗。較佳地，本發明發現雞生長激素基因與雞12S核糖體RNA基因之高度保留DNA片段適合為食品或相關產品中雞之成份專一性檢測對象，並發現針對上述基因之高度保留DNA片段，設計專一性引子對與探針，利用即時PCR(real－time PCR)技術進行檢測，分析推算同一檢體中，雞生長激素基因與雞12S核糖體RNA基因含量之差異，可成功區分僅含雞蛋成分之檢體與含其他雞肉組織之檢體。
根據本發明，本發明方法中所使用之專一性引子對係分別利用雞之高度保留染色體基因與雞之高度保留粒線體基因作為模板而設計。專一性引子之設計係定序分析對雞之高度保留染色體基因與雞之高度保留粒線體基因並經反覆試驗找出具專一性的引子對。任何可與雞之高度保留染色體基因與雞之高度保留粒線體基因具專一性的引子均可用於本發明方法。較佳地，本發明方法之對雞之高度保留染色體基因具專一性的引子對係為對雞之肌肉生長抑制素(myostatin)基因、生長激素(growth hormone)基因、衛星基因(satellite gene)、β肌動蛋白(β－actin)基因、肌凝蛋白(myosin)基因或血紅素(hemoglobin)基因具專一性的引子對。更佳地，本發明方法之對雞之高度保留染色體基因具專一性的引子對為對雞之生長激素基因、肌肉生長抑制素基因或β肌動蛋白基因具專一性的引子對。特佳地，本發明方法之對雞之高度保留染色體基因具專一性的引子對為對雞之生長激素基因具專一性之引子對。根據本發明，較佳地，本發明方法之對雞之高度保留粒線體基因具專一性的引子對係為對12S核糖體RNA基因、16S核糖體RNA基因、細胞色素b(cytochrome b)基因、ATPase subunit 8基因或ATPase subunit 6基因具專一性的引子對。更佳地，本發明方法之對雞之高度保留粒線體基因具專一性的引子對為對12S核糖體RNA基因、16S核糖體RNA基因或細胞色素b(cytochrome b)基因具專一性之引子對。特佳地，本發明方法之對雞之高度保留粒線體基因具專一性的引子對為對12S核糖體RNA基因具專一性的引子對。
根據本發明，為進行即時PCR反應須使用與雞之高度保留染色體基因與雞之高度保留粒線體基因雜交之探針。任何可進行上述雜交之探針均可用於本發明。雜交至雞之高度保留染色體基因之探針較佳為雜交至肌肉生長抑制素(myostatin)基因、生長激素(growth hormone)基因、衛星基因(satellite gene)、β肌動蛋白(β－actin)基因、肌凝蛋白(myosin)基因或血紅素(hemoglobin)基因之探針；更佳為雜交至雞之生長激素基因、肌肉生長抑制素基因或β肌動蛋白基因之探針；特佳為雜交至雞之生長激素基因之探針。根據本發明，雜交至雞之高度保留粒線體基因之探針較佳為雜交至12S核糖體RNA基因、16S核糖體RNA基因、細胞色素b(cytochrome b)基因、ATPase subunit 8基因或ATPase subunit 6基因之探針；更佳為雜交至12S核糖體RNA基因、16S核糖體RNA基因或細胞色素b(cytochrome b)基因之探針；特佳為雜交至12S核糖體RNA基因之探針。
本發明提供一種專一性雜交至雞生長激素基因之引子對，其序列分別為實質上由5'－TAACTTTTGTAAGCGGACACTCAT－3'(SEQ ID NO：1)組成之序列及實質上由5'－GCATTACCTGCGCTGTGGC－3'(SEQ ID NO：2)組成之序列，與一種專一性雜交至雞生長激素基因之探針，其實質上由5'－CCTTCAGGCTTGACAGTGACCTCCAG－3'(SEQ ID NO：3)之序列組成。自待檢測食品或其他產品檢體抽取DNA後，利用前述引子對進行PCR檢測或利用前述引子對與探針進行即時PCR檢測，可專一性檢測該食品或其他產品中是否含有雞之成份。
本發明提供一種專一性雜交至雞12S核糖體RNA基因之引子對，其序列分別為實質上由5'－GAGTGGCCACATGTTATCTGC－3'(SEQ ID NO：4)組成之序列及實質上由5'－TAATCGTTGAGGCTAAGATGG－3'(SEQ ID NO：5)組成之序列，與一種專一性雜交至12S核糖體RNA基因之探針，其為實質上由5'－AGCCTAAGATCCACCTAAACCCAACCCA－3'(SEQ ID NO：6)組成之序列。自待檢測食品或其他產品檢體抽取DNA後，利用前述引子對進行PCR檢測或利用前述引子對與探針進行即時PCR檢測，可專一性檢測該食品或其他產品中是否含有雞之成份。
根據本發明，利用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2與SEQ ID NO：3之引子對與探針，對自食品或其他產品檢體抽出DNA進行即時PCR，並利用SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5與SEQ ID NO：6之引子對與探針，對相同之食品或其他產品檢體抽出DNA進行即時PCR檢測，分析推算雞生長激素基因與雞12S核糖體RNA基因含量之差異，可成功區分該檢體是否僅含雞蛋成分或含其他雞肉組織之成分。
简体摘要：本发明系关于一种可作为区别食品或其他产品中，所含鸡之成分系源自鸡蛋或鸡肉之检验方法，与可专一性检测食品或其他产品中鸡成分之引子对与探针，并可实际应用于市售食品或其他产品之检测。 The invention relates to a detection method of differentiating eggs and chicken in foods or other products and primer pairs and probes used for specifically detecting chicken in foods or other products. The method, primer pairs and probes of the invention can be used in the detection of marketing foods and other products. 【创作特点】发明详细说明本发明系关于一种可作为鉴别食品或其他产品中，所含“鸡”之成分，系源自鸡蛋或鸡肉(含其他鸡蛋以外之鸡之组织)之检验方法与可专一性检测食品或其他产品中鸡成分之引子对与探针，并可实际应用于市售食品或其他产品之检测。本发明提供一种鉴别食品或其他产品中所含鸡之成分系源自鸡蛋或鸡肉之检验方法，其包括将鸡之高度保留染色体基因与鸡之高度保留粒线体基因作为模板设计专一性引子对；及使用所得专一性引子对针对待测检体进行PCR反应；及使用与模板专一性杂交之探针侦测并定量DNA的增幅；其中如仅能检测出鸡之高度保留粒线体基因而未能检测出高度保留染色体基因，则该食品仅含有鸡蛋成分；如若同时检测出鸡之高度保留粒线体基因与高度保留染色体基因，则该检测检体含有鸡肉成份。本发明所称“鸡肉”意指鸡蛋以外之其他鸡组织之成份。本发明所称“鸡蛋”意指鸡蛋未受精或已受精但未高度分化，可供作人类食用者。本发明系利用染色体基因(chromosomal genome)与粒线体基因(mitochondrial genome)拷贝数(copy number)与来源组织细胞数目之差异，并因而造成相当质量或体积之鸡蛋与其他鸡组织中，特定染色体基因与粒线体基因含量之大幅倍数差异，以区分食品或其他产品中，所含鸡之成分系源自鸡蛋或鸡肉。本发明所称利用基因拷贝数之差异系指单一细胞中染色体基因与粒线体基因之拷贝数差异。真核生物之基因体可区分为染色体基因体与粒线体基因体，单一真核细胞之粒线体数量可高达上万个，因此粒线体基因之拷贝数可达上万套。在畜禽动物，单一细胞约含有5,000~10,000个粒线体(科学发展，405期：22~27)，故单一细胞中，染色体基因与粒线体基因之拷贝数差异倍数约可达10 4 倍以上。本发明所称利用成分来源组织细胞数目之差异系指鸡蛋与其他鸡肉组织之细胞数目差异。鸡蛋为单一细胞或仅含少数细胞之组织，故一颗鸡蛋(平均约55公克)与其质量或体积相等之其他鸡肉组织相较，细胞数目之差异约为10 6 倍以上。本发明根据上述事实与推论，选定一染色体基因与一粒线体基因，利用基因拷贝数与成分来源组织之细胞数目之差异，区分食品或其他产品中，所含鸡之成分系源自鸡蛋或鸡肉。於单纯之未受精鸡蛋的情形，由于一颗鸡蛋为单一细胞，因此若选定拷贝数低之染色体基因，则该基因DNA于一颗鸡蛋中含量非常稀少，推测可能无法利用PCR技术进行DNA增幅，或是经PCR增幅DNA数量仍然稀少而难以侦测。然而，选定之粒线体基因在一颗鸡蛋中可多达数百至数万套，DNA含量相对较多，因此可轻易利用PCR技术检测出。在其他鸡肉组织(与一颗鸡蛋质量或体积相等)情形，纵以选定单一细胞中仅一套之染色体基因为检测标的，由于细胞数量多，而该基因总数量亦多，因此亦容易藉PCR增幅DNA后检测出，而粒线体基因在其他鸡肉组织情形，因其拷贝数与细胞数皆多，其总数量更多，必然可检测出。于含鸡蛋之加工食品情形，由于鸡蛋成分被稀释，染色体基因更是难以检测，但粒线体基因则仍可能被检测出。根据本发明，同时以选定之鸡的高度保留染色体基因与粒线体基因，检测食品或相关产品检体，若仅能检测出高度保留之粒线体基因而未能检测出高度保留之染色体基因(或检测出之含量相当低)，则该食品仅含有鸡蛋成分，若同时检测出鸡的高度保留之粒线体基因与染色体基因，则该食品检体含有其他鸡肉组织之成份(亦可能同时含有鸡蛋)。本发明根据上述事实与推论，较佳地，以鸡之高度保留染色体基因与鸡之高度保留粒线体基因为检测对象，设计专一性引子对(primer pair)与探针(probe)，并利用实时PCR(real－time PCR)技术进行检测，分析推算同一检体中，受检测染色体基因与粒线体基因含量之差异，可成功区分仅含鸡蛋成分之检体与含其他鸡肉组织之检体。根据本发明，鸡之高度保留染色体基因，系指任何衍生自普遍存在于鸡之高度保留染色体基因，其包括，但不限于，肌肉生长抑制素(myostatin)基因、生长激素(growth hormone)基因、卫星基因(satellite gene)、β肌动蛋白(β－actin)基因、肌凝蛋白(myosin)基因或血红素(hemoglobin)基因等。较佳地，鸡之高度保留染色体基因系选自生长激素基因、肌肉生长抑制素基因及β肌动蛋白基因。更佳地，鸡之高度保留染色体基因为生长激素基因。根据本发明，鸡之高度保留粒线体基因，系指任何衍生自普遍存在于鸡之高度保留粒线体基因，其包括，但不限于，12S核糖体RNA基因、16S核糖体RNA基因、细胞色素b(cytochrome b)基因、ATPase subunit 8基因或ATPase subunit 6基因等。较佳地，鸡之高度保留粒线体基因系选自12S核糖体RNA基因、16S核糖体RNA基因、细胞色素b(cytochrome b)基因。更佳地，鸡之高度保留粒线体基因为12S核糖体RNA基因。亦可经由比对DNA串行数据库或基因库，确认其他普遍存在于鸡之高度保留基因或DNA片段，以其为检测对象，进行本发明之检验。较佳地，本发明发现鸡生长激素基因与鸡12S核糖体RNA基因之高度保留DNA片段适合为食品或相关产品中鸡之成份专一性检测对象，并发现针对上述基因之高度保留DNA片段，设计专一性引子对与探针，利用实时PCR(real－time PCR)技术进行检测，分析推算同一检体中，鸡生长激素基因与鸡12S核糖体RNA基因含量之差异，可成功区分仅含鸡蛋成分之检体与含其他鸡肉组织之检体。根据本发明，本发明方法中所使用之专一性引子对系分别利用鸡之高度保留染色体基因与鸡之高度保留粒线体基因作为模板而设计。专一性引子之设计系定序分析对鸡之高度保留染色体基因与鸡之高度保留粒线体基因并经反复试验找出具专一性的引子对。任何可与鸡之高度保留染色体基因与鸡之高度保留粒线体基因具专一性的引子均可用于本发明方法。较佳地，本发明方法之对鸡之高度保留染色体基因具专一性的引子对系为对鸡之肌肉生长抑制素(myostatin)基因、生长激素(growth hormone)基因、卫星基因(satellite gene)、β肌动蛋白(β－actin)基因、肌凝蛋白(myosin)基因或血红素(hemoglobin)基因具专一性的引子对。更佳地，本发明方法之对鸡之高度保留染色体基因具专一性的引子对为对鸡之生长激素基因、肌肉生长抑制素基因或β肌动蛋白基因具专一性的引子对。特佳地，本发明方法之对鸡之高度保留染色体基因具专一性的引子对为对鸡之生长激素基因具专一性之引子对。根据本发明，较佳地，本发明方法之对鸡之高度保留粒线体基因具专一性的引子对系为对12S核糖体RNA基因、16S核糖体RNA基因、细胞色素b(cytochrome b)基因、ATPase subunit 8基因或ATPase subunit 6基因具专一性的引子对。更佳地，本发明方法之对鸡之高度保留粒线体基因具专一性的引子对为对12S核糖体RNA基因、16S核糖体RNA基因或细胞色素b(cytochrome b)基因具专一性之引子对。特佳地，本发明方法之对鸡之高度保留粒线体基因具专一性的引子对为对12S核糖体RNA基因具专一性的引子对。根据本发明，为进行实时PCR反应须使用与鸡之高度保留染色体基因与鸡之高度保留粒线体基因杂交之探针。任何可进行上述杂交之探针均可用于本发明。杂交至鸡之高度保留染色体基因之探针较佳为杂交至肌肉生长抑制素(myostatin)基因、生长激素(growth hormone)基因、卫星基因(satellite gene)、β肌动蛋白(β－actin)基因、肌凝蛋白(myosin)基因或血红素(hemoglobin)基因之探针；更佳为杂交至鸡之生长激素基因、肌肉生长抑制素基因或β肌动蛋白基因之探针；特佳为杂交至鸡之生长激素基因之探针。根据本发明，杂交至鸡之高度保留粒线体基因之探针较佳为杂交至12S核糖体RNA基因、16S核糖体RNA基因、细胞色素b(cytochrome b)基因、ATPase subunit 8基因或ATPase subunit 6基因之探针；更佳为杂交至12S核糖体RNA基因、16S核糖体RNA基因或细胞色素b(cytochrome b)基因之探针；特佳为杂交至12S核糖体RNA基因之探针。本发明提供一种专一性杂交至鸡生长激素基因之引子对，其串行分别为实质上由5'－TAACTTTTGTAAGCGGACACTCAT－3'(SEQ ID NO：1)组成之串行及实质上由5'－GCATTACCTGCGCTGTGGC－3'(SEQ ID NO：2)组成之串行，与一种专一性杂交至鸡生长激素基因之探针，其实质上由5'－CCTTCAGGCTTGACAGTGACCTCCAG－3'(SEQ ID NO：3)之串行组成。自待检测食品或其他产品检体抽取DNA后，利用前述引子对进行PCR检测或利用前述引子对与探针进行实时PCR检测，可专一性检测该食品或其他产品中是否含有鸡之成份。本发明提供一种专一性杂交至鸡12S核糖体RNA基因之引子对，其串行分别为实质上由5'－GAGTGGCCACATGTTATCTGC－3'(SEQ ID NO：4)组成之串行及实质上由5'－TAATCGTTGAGGCTAAGATGG－3'(SEQ ID NO：5)组成之串行，与一种专一性杂交至12S核糖体RNA基因之探针，其为实质上由5'－AGCCTAAGATCCACCTAAACCCAACCCA－3'(SEQ ID NO：6)组成之串行。自待检测食品或其他产品检体抽取DNA后，利用前述引子对进行PCR检测或利用前述引子对与探针进行实时PCR检测，可专一性检测该食品或其他产品中是否含有鸡之成份。根据本发明，利用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：3之引子对与探针，对自食品或其他产品检体抽出DNA进行实时PCR，并利用SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6之引子对与探针，对相同之食品或其他产品检体抽出DNA进行实时PCR检测，分析推算鸡生长激素基因与鸡12S核糖体RNA基因含量之差异，可成功区分该检体是否仅含鸡蛋成分或含其他鸡肉组织之成分。

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