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    • 22. 发明专利
    • Proteínas de fusión recombinantes y bibliotecas de repertorios de células inmunitarias
    • ES2906132T3
    • 2022-04-13
    • ES16808004
    • 2016-05-18
    • GIGAGEN INC
    • JOHNSON DAVIDADLER ADAMMIZRAHI RENA
    • C12Q1/66C07K16/00
    • Método in vitro para preparar una biblioteca de anticuerpos de longitud completa recombinantes, que comprende: proporcionar células inmunitarias primarias obtenidas previamente de al menos un donante mamífero; aislar en una pluralidad de gotas monodispersas células inmunitarias individuales a partir de dichas células inmunitarias primarias; generar una pluralidad de polinucleótidos de fusión recombinantes que comprenden, cada uno, un primer polinucleótido que codifica para un dominio variable de cadena pesada y un segundo polinucleótido que codifica para un dominio variable de cadena ligera, en el que dicho dominio variable de cadena pesada y dicho dominio variable de cadena ligera en cada uno de dicha pluralidad de polinucleótidos de fusión recombinantes son un par análogo de una de dichas células inmunitarias primarias aisladas, en el que cada uno de dicha pluralidad de polinucleótidos de fusión recombinantes comprende además un polinucleótido ligador que liga dichos polinucleótidos primero y segundo; circularizar a través de ensamblaje de Gibson cada uno de dicha pluralidad de polinucleótidos de fusión recombinantes lineales; e insertar un tercer polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para un promotor y una secuencia que codifica para una región constante entre dichos polinucleótidos primero y segundo en cada uno de dichos polinucleótidos de fusión recombinantes circularizados, generando de ese modo al menos 1.000 constructos de expresión de anticuerpos de longitud completa recombinantes únicos, generando de ese modo una biblioteca de anticuerpos de longitud completa recombinantes, en el que la etapa de aislar células inmunitarias individuales a partir de dichas células inmunitarias primarias comprende encapsular dichas células inmunitarias individuales en una pluralidad de gotas monodispersas con perlas que comprenden sondas de ácido polinucleico unidas con secuencias que son complementarias tanto a polinucleótidos que codifican para dominios variables de cadena pesada como a polinucleótidos que codifican para dominios variables de cadena ligera en una mezcla de reacción que lisa las células inmunitarias primarias y fomenta la hibridación de ácido polinucleico, lo que permite que las perlas capturen polinucleótidos que codifican para dominios variables de cadena pesada y polinucleótidos que codifican para dominios variables de cadena ligera.